Proteom-afledte peptidbiblioteker til dyb specificitetsprofilering af N-terminale modifikationsreagenser

Protein- og peptid N-termini er vigtige mål for selektiv modifikation med kemoproteomiske reagenser og biokonjugeringsværktøjer. Den N-terminale a-amin forekommer kun én gang i hver polypeptidkæde, hvilket gør det til et attraktivt mål for proteinbiokonjugation. I celler, nye N-termini kan genereres ved proteolytisk spaltning og indfanges af N-terminale modifikationsreagenser, der muliggør proteom-dækkende identifikation af proteasesubstrater med tandem massespektrometri (LC-MS/MS). En forståelse af den N-terminale sekvensspecificitet af modifikationsreagenserne er kritisk for hver af disse anvendelser. Proteom-afledte peptidbiblioteker i kombination med LC-MS/MS er kraftfulde værktøjer til profilering af sekvensspecificiteten af ​​N-terminale modifikationsreagenser. Disse biblioteker er meget forskellige, og LC-MS/MS muliggør analyse af modifikationseffektiviteten af ​​titusindvis af sekvenser i et enkelt eksperiment. Proteom-afledte peptidbiblioteker er et kraftfuldt værktøj til profilering af sekvensspecificiteterne af enzymatiske og kemiske peptidmærkningsreagenser. Subtiligase og 2-pyridincarboxaldehyd (2PCA) er to reagenser, der er udviklet til selektiv N-terminal peptidmodifikation og kan studeres ved hjælp af proteomafledte peptidbiblioteker. Denne protokol skitserer trinene til generering af N-terminalt forskellige proteom-afledte peptidbiblioteker og til at anvende disse biblioteker til at profilere specificiteten af ​​N-terminale modifikationsreagenser. Vi detaljerer trinene til profilering af specificiteten af ​​2-pyridincarboxaldehyd, et kemisk modifikationsreagens, og subtiligase, et enzymatisk modifikationsreagens. Disse protokoller kan let tilpasses til alternative proteomkilder og andre N-terminale peptidmærkningsreagenser.