Ya ku Reagentek Xerabkirin-Daxuyandî Bi rastî Pêdivî ye ku bike
Berî nirxandina QC, ew ji veqetandina çînên reagentê yên têkildar re dibe alîkar. Rêbernameyên standard proteomîk û sondayên kîmyewî nûçegihanên fluorescent cuda dikin, lêkolînên-based çalakiyê, û reagents-dewlemendkirin, her pergala ubiquitin-proteasome veguherîne (UPS) çalakî di nav hucreyan de di xwendinek pîvandî de, lysates, an reaksiyonên bê şaneyê.
-
Labelên florescent dihêlin hûn enzîmên çalak binerin an hejmartin, binbeşên proteazomê, an jî substratên nûçegihan bi fluorescence di-gel, mîkroskopî, an nûçegihanên qezenc / windabûna sînyala.
-
Etîketên biotin amûrên dewlemendkirinê ne, girtina deubiquitinases çalak (DUBs) an jî proteînên guhezbar bi streptavidin vekêşana berî immunoblotting an nasnameya girseyî.
-
Lêkolînên Ubiquitin û NEDD8-mimetîkî û substratên fluorogenîk an FRET enzîm û lîgazên ku divê ubiquitin ji guhêrbarên mîna ubiquitin-ê cuda bikin dipirsin - kîmya ku biryarê dide ka bûyerek hilweşandinê ya armanckirî bi rastî qewimî..
-
Substratên hilweşandinê rêzek bêîstabîlîzker an degron hildigirin da ku windahiyek bi tevlihev an jî bi proteazomê ve girêdayî guheztinek nîşana pîvandî çêbike..
Her yek ji van rolan li ser hûrguliyek piçûk a strukturel bazirganî dike: kîjan bermayiyê etîketkirî ye, cihê ku guherînek lê rûniştiye, gelo girêdanek isopeptide an oxyester rast e, û gelo serê cengê li dawiya rast heye. Reagentek ku "95% paqijiya" wê îzomerek des-amîdkirî an jêbirinê ya serdest vedişêre dikare girêdanê biguhezîne., nehejî, an rêjeya hilweşandinê ya diyar têra şekilkirina şîroveya tevahî ekranek e.
Peptîdên Labelkirî Pêdiviya Pejirandina Label-Taybetî ne
Etîketek fluorescent an biotin ne pêvekek pasîf e. Tevlihevî di kromatografiyê de hem dema ragirtinê û hem jî ionîzasyonê diguherîne, û ew guheztinek girseyî ya pêşbînîkirî destnîşan dike - lê tenê heke celebê armanc ew e ku çêbibe.
Qalîteya reagentê li vir tê wateya pejirandinê etîket kirin cureyên, ne tenê peptîdê dêûbav. Ew bi gelemperî hewce dike:
-
Senteza Peptîdê verastkirina girseya spektrometrî ya etîketa lêzêdekirî bi guheztina girseyî ya çaverêkirî;
-
LC-MS an UPLC kontrol dike da ku piştrast bike ku molekula nîşankirî wekî ku hatî destnîşan kirin dişewitîne û iyonîze dike., cureyên serdest;
-
raporkirina nasnameya cuda ji bo label, ji ber ku behremendiya wê ya guhezbar dikare hilberên alîgir ên hev-hilber mask bike.
Ji bo biotin, xem dilsoziya dewlemendkirinê ye: pirek bi qismî nîşankirî an xelet-biotinylated dikare streptavidin bi rengek cûda ve girêbide û komek xelet a proteînan hilweşîne.. Ji bo fluorophores, moda têkçûnê cûda ye lê bi heman rengî têkbirker e - nepakîyek ku di dirêjahiya pêlê de fluoress dike, sînyala rastîn teqlîd dike û rêjeyên lêdanê zêde dike.. Laboratuvarên vekolînê her ku diçe ji firoşkaran dipirsin ku girseya tam nîşankirî û kromatogramek hevkêşeya dawîn ragihînin., ne tenê paqijiya rêzê.
Guhertinên Assay-Taybetî Divê werin Verast kirin, Ne tê texmîn kirin
Reagentên hilweşandinê bi gelemperî ne peptîdên sade ne. Ew hêmanên ubiquitin-mimetic an NEDD8-mimetic hildigirin, serikên şer ên elektrofîl, destikên affinity, linkers, û FRET an cotên fluorogenic. Barê delîlan li ser piştrastkirina wê ye armanc kirin avahî li ser pir serdest e û ew îsomerek nexwestî tune, qutkirin, an hilbera alîgir di astekê de kom bûye ku vekolînê xera dike.
Ji bo aliyê biçûk-molekulê yên degraders, pratîka analîtîk jixwe eşkere ye: pakêtek bihêz LC-MS an HPLC ji bo paqijiya organîk bikar tîne, NMR an qNMR ji bo avahî û hevsengiya girseyê, û bi gelemperî analîza chiral an metal ji bo girtina epîmerîzasyona stereocenter û gemarên şop-metal ên ku dikarin hevrêziya zinc bitemirînin bigirin.. Reagentên peptîd û proteîn ên ku heman ekranan dixwin heman dîsîplînê heq dikin - verastkirina cîhê guherandinê, tesdîqkirina girêdan û dawîyê, û zelaliya ka gelo nepakiya serdest dikare di xwendina biyolojîkî de asteng bike.
Sequence Fidelity Non-Negotiable e
Pirtûkxane û komên lêpirsînê bi gelemperî li dijî avahiyek bingehîn a diyarkirî ku degronek şîfre dike têne ferman kirin., motîfeke naskirinê, cîhek qutkirina enzîmê, an sînyalek girêdayî fosforîlasyonê. Pêbaweriya rêzikê tê vê wateyê ku avahî ew e ya ku bi rastî hatî şandin - bêyî jêbirin, cîgir tune, ne misînkorporasyon, û rast N- û C-termini.
Fidelity ew e ku kurtebirên pola lêkolînê pir caran derdikevin holê. Firoşkarek ku girseya saxlem bi tenê piştrast dike dikare îzomerek jêbirinê ya bi heman girseya navî ji dest bide, an malperek fosfo ku li ser bermahiyek xelet hatî saz kirin. Baweriya asta rêzê hewceyê nexşeya peptîd an perçebûna MS / MS hewce dike, analîza amino-asîdê ji bo pêkhatinê, û - ji bo avahiyên ku bi giranî hatine guheztin - pejirandina ku her komek sazkirî li cîhê armanc rûniştiye. Dema ku dîmenderek têkçûyî ya têkçûyî an encamek DUB-ya matmayî vedigere "Rêza substratê bi yek bermayiyê xelet bû,” lêçûn hefteyek daneyên neberber e ku tu nermalava jêrîn nikare rast bike.
Piştrastkirina analîtîk a ortogonal Baweriyê bilind dike
Nîşanek analîtîkî ya yekane kêm kêm nasnameyê destnîşan dike. Rêbernameya Ajansa Dermanên Ewropî li ser pêşveçûnî Peptîdên sentetîk û çêkirina peptîdên sentetîk ji bo nasnameyê bi kêmî ve du rêbazên ortogonal pêşniyar dike, û mezinahiya ortogonal-, biha-, û nêzîkatiyên hîdrofobî-bingeha ji bo taybetmendiya paqijiyê.
Piştrastkirina ortogonal ji bo reagentên binavkirî û guhezbar ji peptîdên xêzik ên rasterast bêtir girîng e., ji ber ku tu rêbazek kromatografiyê her malbatek nepakiyê çareser nake. Kîmyavanek ku avahiyek ceribandinê ya tevlihev kontrol dike dê bi gelemperî HPLC-qonaxa berevajîkirî bi kîmya stûna duyemîn re heval bike., erêkirina girseyî bi MS / MS an nexşeya peptîdê re tevlihev bikin, û rêbazên armanckirî yên wekî veqetandina chiral ji bo yekparebûna stereokîmyayî an dûrxistina mezinbûnê bi belavkirina ronahiya pir-goşe ji bo rewşa kombûnê zêde bikin. Dema ku reagent xwendinek hejmarî dide, ev delîlên qat e ya ku dihêle hûn pê bawer bin ku îddîayên nasname û paqijiyê rast in û ji nû ve têne hilberandin - ne ji sedî yek-herêma lûtkeyê.
Kitêbxaneyên Screening Li ser Pêdengiya Batchê Dijîn an Dimirin
Pirtûkxaneyên vekolînê ji gelek bîran têne çêkirin, gelek fîşekan, û - heya ku hûn pêşî plan nekin - gelek lotikên hilberînê. Guherbariya hevber-hevî kujerê bêdeng a ekranên dirêjî ye, ji ber ku di nav nepaqijiyek piçûk de an şopa tiliya kromatografî ya guhezbar tevgera ceribandinê diguhezîne tewra dema ku her beş bi navgînî pîvana paqijiya xwe derbas bike.
Disîplîna hevgirtinê ji sê beşan pêk tê:
-
Gelek şopandin - her fîşek an plakaya pirtûkxaneyê bi nasnameyek berhevokek rastîn û sertîfîkayek analîzê ya taybetî-heviyê ve girêdide, ji ber vê yekê her encamek dikare bi materyalê ku ew hilberandiye were şopandin.
-
Berhevdana şopa tiliyê - Lûtên nû ji hêla dema ragirtinê ve li hember lotikên berê û standardên referansê têne berhev kirin, gel, û profîla nepakiyê, ne tenê bi jimareyek paqijiya derbasbûn / têkçûn.
-
Daneyên xav ên belgekirî - delîlên objektîf (kromatogram, spektrên girseyî) bi her komekê re ji sedî kurtahî tê peyda kirin, ji ber vê yekê laboratîfên vekolînê dikarin bi xwe hevrêziyê dadbar bikin. Hilberîna Peptîdê
Rêbaza pratîkî ji bo pirtûkxaneyek mezin a xirabker an lêkolîner ew e ku meriv ji hevalbendek ku şopandina tiliyên hevrikî wekî rûtîn dihesibîne û dikare destnîşan bike ka pirek diyarkirî çawa bi ya ku lêdanên weyên berê erê kiriye re tê berhev kirin..
Protein-Degradation Screening Nota: Dema ku hûn çavkaniyê didin "Têra baş" çi dixuye
Dema ku hûn reagentek diyar bikin an dabînkerek binirxînin hûn dikarin van hemî li komek kurt a hêviyan wergerînin. Di pratîkê de, laboratîfên ku karûbarên hilweşandinê dimeşînin li hevkaran digerin ku dê QC-ya li pişta diyarkirî nîqaş bikin senteza peptide custom emir li şûna ku yek jimareyek paqijiyê bide dest.
Ya bingehîn in: nasname ji hêla girseya saxlem ve bêtir hatî pejirandin; etîket û her guheztinek li ser hevbenda paşîn hatî rast kirin; li cîhê ku hewce be bi amino-asîdê an analîza asta nexşeyê ve rastbûna rêzikê hatî belge kirin; rêbazên analîtîk ên ortogonal ên li pişt îdîayên paqijî û taybetmendiyê; yek testkirina peptîdê qeyda ku kromatogramên xav û spektrên girseyê ji her lotikê re vedihewîne; û hevgirtina şop-tiliya li seranserê pirtûkxaneyê tê domandin.
Platformek sentezê ya navdar dê veqetandina ortogonal-asta girtinê bîne, Pejirandina asta MS / MS, sînorên endotoxin û biyobardenê, û belgeyên asta pir li ser sifrê - ji ber ku ew ferqa di navbera reagentek e ku ekranek paqij çêdike û ya ku bi bêdengî pozîtîfên derewîn di nav sed bîran de çêdike..
Key Takeaway: Di vekolîna proteîn-hilweşînê de, kalîteya reagentê rastdariya ceribandinê ye. Cureyên nîşankirî li ser rêza dêûbav verast bikin, her malpera guherandinê piştrast bikin, rêbazên analîtîk ên ortogonal bikar bînin, û hevgirtina şopa tiliyê ya hevberî bicîh bikin - ji ber ku xwendin dê bi bêdengî nîşan bide kîjan ji van hatî paşve xistin.
Steps Next
Bi nivîsandina dersên reagentê dest pê bikin ku dîmendera we bi rastî pê ve girêdayî ye - nûçegihan, lêpirsîn, an substrate - û belgeya analîtîk ku her yek hewce dike. Dema ku hûn çavkaniyê didin wê wekî bingehîn bikar bînin, û ji dabînkeran bipirsin ku hûn bi rêbazên ortogonal û delîlên şopa tiliyên pir-bi-pir li pişt materyalê ku hûn ê bimeşînin. Çend hûrdeman ku li pêş çavê QC-yê hatî derbas kirin dikare we ji encamek vekolînek bêserûber ku hefte didomîne xilas bike..
