ለ Luminex Multiplex Immunoassays የፔፕታይድ ደረጃዎችን መንደፍ: ላብ-ዝግጁ ፕሮቶኮል
Multiplex ዶቃ ላይ የተመሠረተ ማንጠልጠያ ድርድሮች, እንደ Luminex xMAP እና MagPlex ቴክኖሎጂዎች, በባለብዙ-ትንታኔ ፓነሎች ላይ ትክክለኛ አሃዛዊ መረጃን ለማቅረብ በከፍተኛ ደረጃ ተለይተው የሚታወቁ ካሊብሬተሮችን ይተማመኑ. እንደገና የተዋሃዱ ባለ ሙሉ ርዝመት ፕሮቲኖች በታሪክ እንደ መደበኛ ካሊብሬተሮች ሆነው አገልግለዋል።, ሰው ሰራሽ peptides ለኤፒቶፕ-ተኮር አሃዛዊ የወርቅ ደረጃ ወጥተዋል።, የባዮማርከር ማረጋገጫ, እና ከፍተኛ-የጸረ-ሰው መገለጫ. ሰው ሠራሽ peptides የተወሰነ ስቶይቺዮሜትሪ ይሰጣሉ, አነስተኛ የሎት-ወደ-ሎጥ መዋቅራዊ ልዩነት, እና ወጪ ቆጣቢ scalability.
ቢሆንም, ጥሬ የፔፕታይድ ቅደም ተከተል ወደ የተረጋገጠ የበሽታ መከላከያ ደረጃ መተርጎም ጥብቅ ኬሚካላዊ ዲዛይን እና ባዮኮንጁጅሽን ማመቻቸትን ይጠይቃል።. አነስተኛ ሰው ሠራሽ peptides (<30 አሚኖ አሲዶች) በቀጥታ በካርቦክሳይድ ማይክሮስፌር ላይ በሚንቀሳቀስበት ጊዜ የኤፒቶፕ ጭንብልን በብዛት ያሳያል, ልዩ ያልሆነ የሃይድሮፎቢክ ማስታወቂያ, ወይም ትክክለኛ ያልሆነ የስበት ኃይል ማጎሪያ ልኬት በተቃውሞ ብዛት መዛባት ምክንያት የሚፈጠር.
ይህ ለቤንች ዝግጁ የሆነ ፕሮቶኮል ዲዛይን ለማድረግ ባለ 5-ደረጃ ዘዴን ይዘረዝራል።, ማሻሻያ ማድረግ, መጋጠሚያ, እና ማረጋገጥ ለ Luminex multiplex immunoassays peptide ደረጃዎች, ከፍተኛውን የኤፒቶፔ ተደራሽነት ማረጋገጥ, ዝቅተኛ ምላሽ ሰጪነት, እና ጥብቅ የመራቢያ ችሎታ. Dipeptide ጅምላ
ደረጃ 1: የቅደም ተከተል ምርጫ እና የሊንከር አርክቴክቸር
ፖሊቲሪሬን ወይም መግነጢሳዊ ዶቃዎች ላይ አጫጭር ሰው ሠራሽ peptides እንዳይንቀሳቀሱ ማድረግ ብዙውን ጊዜ ወደ ከባድ እንቅፋት ያመራል።, ዶቃው ማትሪክስ የፀረ-ሰው ለቁልፍ ማያያዣ ቀሪዎች መዳረሻን የሚከለክልበት. ምርጥ ቅደም ተከተል ንድፍ አካላዊ መረጋጋትን ያመዛዝናል, የተጣጣመ ተጣጣፊነት, እና ጣቢያ-ተኮር አቀራረብ.
1. የኤፒቶፕ ካርታ እና ቅደም ተከተል ርዝመት
- አነስተኛ የኤፒቶፕ መለያ: ዋና መስመራዊ ወይም ቀጣይነት ያለው የተስማሚ ማሰሪያ ጭብጦችን ለይ (በተለምዶ 8-15 አሚኖ አሲዶች).
- የጎማ ቅሪቶች: 2-4 ቤተኛ ኤን- እና C-terminal flanking አሚኖ አሲዶች የአካባቢያዊ ሁለተኛ ደረጃ መዋቅርን እና ionክ መሟሟትን ለመጠበቅ.
- የሃይድሮፎቢቲዝም ቅነሳ: የሃይድሮፓቲቲቲ ታላቁን አማካይ አስላ (ግራቪ) ነጥብ. ከፍተኛ የሃይድሮፎቢክ ቀሪዎች ያላቸው ቅደም ተከተሎች (ትራፕ, ፒ, ልኡ, ጋር) በሃይድሮፎቢክ ፖሊቲሪሬን ዶቃ ኮር ላይ ይወድቃል, ወደ ከፍተኛ ልዩ ያልሆነ ትስስር ይመራል (NSB). የሚሟሟ መለያዎችን ያካትቱ (እንደ ሊስ-ላይስ ወይም ግሉ-ግሉ ተጨማሪዎች በኤፒቶፕ ባልሆኑ ተርሚኒ) አስፈላጊ ከሆነ.
2. ስፔሰርስ እና ተጣጣፊ ማያያዣዎች
ከዶቃው ሃይድሮዳይናሚክ የድንበር ሽፋን ባሻገር ያለውን ኤፒቶፕ ለማቀድ, በተግባራዊ መጋጠሚያ እጀታ እና በዒላማው ቅደም ተከተል መካከል የሃይድሮፊሊክ ስፔሰርን ያስገቡ.
- PEG Spacers: ፖሊ polyethylene glycol ማያያዣዎች (PEG2, PEG4, ወይም PEG12) ከጠንካራ የሃይድሮካርቦን ሰንሰለቶች ጋር ሲነፃፀር የላቀ የውሃ መሟሟት እና ዜሮ የበሽታ መከላከያዎችን መስጠት.
- አሚኖ-ሄክሳኖይክ አሲድ (አሀሀሀ): ከ1-2 nm አካላዊ ማካካሻ ለሚያስፈልጋቸው መካከለኛ የሃይድሮፊል ቅደም ተከተሎች ተስማሚ.
ለጠቃሚ ምክር: ሁልጊዜ ተጣጣፊውን የ PEG ስፔሰርን በተቀላጠፈ መጋጠሚያ ቦታ መካከል ያድርጉት (ለምሳሌ., ኤን-ተርሚናል አሚን ወይም ተርሚናል ሳይሲስ) እና ኤፒቶፕ. ያለ ስፔሰር ቀጥተኛ ትስስር ፀረ እንግዳ አካላት ትስስርን በ40-70% ይቀንሳል።.
ደረጃ 2: ጣቢያ-ተኮር ማሻሻያ እና መለያ ኬሚስትሪ
በዘፈቀደ ወይም በአቅጣጫ ያልሆነ መጋጠሚያ የኤፒቶፔን ቅርፅን ይቀይራል እና የባች-ወደ-ባች አቅጣጫ መለዋወጥን ያስከትላል. ጣቢያ-ተኮር ኬሚካላዊ ማሻሻያ በሁሉም ጥቃቅን አካባቢዎች ላይ ወጥ የሆነ የቦታ አቀራረብን ያረጋግጣል.
| የአቅጣጫ የማይንቀሳቀስ አማራጮች | ዝርዝር |
|---|---|
| አማራጭ ሀ | ኤን-ተርሚነስ / Lys Amine PEG4 Spacer → EDC/S-NHS Amide Bond → COOH-MagPlex Bead |
| አማራጭ ለ | ተርሚናል ባዮቲን መለያ PEG4 Spacer → Streptavidin Capture → Avidin-MagPlex Bead |
| አማራጭ ሐ | የተርሚናል ሳይስቴይን ቲዮል ማሌይሚድ እጀታ → ቲዮተር ትስስር → አሚን-ማግፕሌክስ ዶቃ |
1. ባዮቲኒላሽን vs. ቀጥተኛ አሚን መጋጠሚያ
- ተርሚናል ባዮቲኒላሽን: N-terminal Biotin ወይም Lysን በማካተት ላይ(ባዮቲን) በ PEG4 ማገናኛ በኩል በፍጥነት ይፈቅዳል, በStreptavidin-የተሸፈኑ MagPlex ማይክሮስፈርስ ላይ ከፍተኛ-ግንኙነት አለመንቀሳቀስ (K d ≈ 10^{-14} ኤም). ይህ በመመርመሪያ ዝግጅት ወቅት የኦን-ቢድ ካርቦዲሚድ ኬሚስትሪን ያስወግዳል.
- ቀጥተኛ አሚን መጋጠሚያ: ካርቦሃይድሬት የሚጠቀሙ ከሆነ (COOH) MagPlex ማይክሮስፌር, peptide ብቻ መያዙን ያረጋግጡ አንድ የመጀመሪያ ደረጃ አሚን (N-terminus). ፀረ እንግዳ አካላትን ለይቶ ማወቅን የሚረብሽ የተለያዩ ባለብዙ ነጥብ ትስስርን ለመከላከል በኤፒቶፕ ውስጥ ያሉት የውስጥ የላይሲን ቅሪቶች በሚዋሃዱበት ጊዜ መተካት ወይም መጠበቅ አለባቸው።.
2. የፍሎረሰንት መለያ ለባለብዙ ፕላክስ የጥራት ቁጥጥር
የሪፖርት ማሰራጫዎችን ሲያረጋግጡ ወይም ዶቃ የመጫኛ ጥንካሬን ሲከታተሉ, orthogonal fluorophores (ለምሳሌ., አሌክሳ ፍሎር 488 ወይም FITC) ከማይወዳደሩ የላይሳይን የጎን ሰንሰለቶች ጋር ሊጣመር ይችላል።.
- Spectral ተኳኋኝነት: የመለያ ቅስቀሳ/ልቀቶች ከውስጥ Luminex ምደባ ሌዘር ጋር እንዳይደራረቡ ያረጋግጡ (ቀይ / ኢንፍራሬድ ማቅለሚያዎች በ 658 nm እና 712 nm, ወይም አረንጓዴ ዘጋቢ ቻናሎች በ 525 nm በ Intelliflex ስርዓቶች ላይ).
ደረጃ 3: Luminex MagPlex Bead Coupling Protocol
ካርቦክሳይድ xMAP ማይክሮስፌር (MagPlex COOH) የገጽታ ካርቦክሲል ቡድኖችን ይይዛል (~ 10 ⁷ COOH / ዶቃ) 1-ethyl-3-ን በመጠቀም በሁለት-ደረጃ ካርቦዲሚድ ኬሚስትሪ ከዋና አሚኖች ጋር ምላሽ የሚሰጥ(3-dimethylaminopropyl)ካርቦዲሚድ (ኢ.ዲ.ሲ) እና N-hydroxysulfosuccinimide (ሰልፎ-ኤንኤችኤስ).
| የፕሮቶኮል ደረጃ | ቋት / ሬጀንት | ምላሽ መለኪያዎች | ዋና ዓላማ |
|---|---|---|---|
| 1. ዶቃ ማጠቢያ | 100 mM MES, ፒኤች 6.0 | 2.5 × 10⁶ ዶቃዎች, አዙሪት & መግነጢሳዊ መለያየት | የማጠራቀሚያ መከላከያዎችን ያስወግዱ እና የተመጣጠነ ገጽታ |
| 2. COOH ማግበር | 50 mg/ml EDC + 50 mg/mL Sulfo-NHS በMES | መክተት 20 በደቂቃ በ RT በየዋህነት ማሽከርከር | COOH ወደ መረጋጋት ቀይር, amine-reactive Sulfo-NHS esters |
| 3. የማንቃት ማጠቢያ | 50 mM MES, ፒኤች 6.0 | 2× በማግበር ቋት ይታጠቡ | ምላሽ ያልሰጠውን EDC ያስወግዱ, የዩሪያ ምርቶች, እና ከመጠን በላይ Sulfo-NHS |
| 4. Peptide መጋጠሚያ | ፒ.ቢ.ኤስ (ፒኤች 7.2-7.4) + 10-20µg peptide | መክተት 2 h በ RT ወይም በአንድ ሌሊት በ 4 ° ሴ | ከዋና አሚኖች ጋር ኮቫለንት አሚድ ቦንዶችን ይፍጠሩ |
| 5. ማጥፋት | 1 ኤም ኢታኖላሚን (ፒኤች 9.0) ወይም 50 mM Tris (ፒኤች 8.0) | መክተት 30 ደቂቃ በ RT | ልዩ ያልሆነ ትስስርን ለመከላከል ሃይድሮላይዝ ያልተደረገ ኤን ኤችኤስ-ኢስተር |
| 6. ማገድ / ማከማቻ | ፒ.ቢ.ኤስ, 1% BSA, 0.05% ሶዲየም አዚድ, ፒኤች 7.4 | በጨለማ ውስጥ በ2-8 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ውስጥ ያስቀምጡ | ለረጅም ጊዜ ማከማቻነት የተዋሃዱ ማይክሮስፈሮችን አረጋጋ |
ወሳኝ የማጣመር አፈፃፀም መመሪያዎች
- የማግበር ቋት መቆጣጠሪያ: የካርቦክሲል ማግበርን በ ፒኤች 6.0-6.3 በ MES ቋት ውስጥ. የ EDC ቅልጥፍና በፒኤች ላይ በከፍተኛ ሁኔታ ይቀንሳል > 7.0.
- ትኩስ Reagent ዝግጅት: EDC እና Sulfo-NHS ሃይግሮስኮፒክ እና ሃይድሮላይዝድ በፍጥነት በውሃ መፍትሄዎች ላይ ናቸው።. ከመጨመራቸው በፊት የደረቁ አሊኮችን ወዲያውኑ ይፍቱ; እንደገና የተገነቡ የአክሲዮን መፍትሄዎችን አታከማቹ.
- አሚን-ነጻ የማጣመር ደረጃ: በደረጃ ወቅት 4, የማጣመጃው ቋት ከዋና አሚኖች ወይም ኑክሊዮፊል የጸዳ መሆን አለበት።. ትሪስን ያስወግዱ, ግሊሲን, ወይም ሶዲየም አዚድ በማጣመጃው ቋት ውስጥ, ተፎካካሪ ኑክሊዮፊል ንቁ ኤን ኤች ኤስ-ኤስተሮችን ስለሚበሉ እና የፔፕታይድ ትስስር ምርትን ስለሚቀንስ.
⚠️ ማስጠንቀቂያ: BSA በጭራሽ አታስተዋውቅ, ሴረም, ወይም ከደረጃው በፊት gelatin 5. በማጣመር ሂደት ውስጥ የፕሮቲን ማገጃዎችን መጨመር ወደ ዶቃዎች ከባድ የፕሮቲን ውህደትን ያስከትላል, ሰው ሰራሽ የፔፕታይድ ደረጃን ሙሉ በሙሉ መደበቅ.
ደረጃ 4: Multiplex Cross-reactivity & ልዩ ያልሆነ አስገዳጅ መከላከል
Multix Luminex ፓነል ውስጥ (ለምሳሌ., 10-plex ወደ 50-plex), ተሻጋሪ ምላሽ በሁለት የተለያዩ መገናኛዎች ላይ ሊከሰት ይችላል።: ፀረ-ሰው-ወደ-ያልሆነ-ዒላማ-peptide ማሰር እና ከፔፕታይድ ወደ ዶቃ ልዩ ያልሆነ ማስታወቂያ. ሰው ሠራሽ Peptides አምራች
1. ማትሪክስ ክሮስ-ሪአክቲቭ ስክሪን (5×5 የቼክ ሰሌዳ ማረጋገጫ)
ባለብዙክስ ፓነል ውስጥ ከመቆለፉ በፊት, ሙሉ ነጠላ-ትንታኔን ያከናውኑ. multiplex ማትሪክስ ማጣሪያ:
- የግለሰብ የመጀመሪያ ደረጃ ፀረ እንግዳ አካላት በሁሉም የማይንቀሳቀሱ የፔፕታይድ ዶቃ ክልሎች ላይ በተናጠል መከተብ አለባቸው.
- ዒላማ ባልሆኑ ዶቃ ክልሎች ላይ የሲግናል መፍሰስ መብለጥ የለበትም 1.5% የተወሰነ የዒላማ ምልክት በከፍተኛ የካሊብሬተር ትኩረት (ቢ ከፍተኛ).
- ተሻጋሪ ምላሽ ከተፈጠረ, ቅደም ተከተላቸው መስመራዊ ሆሞሎጂን ይጋራ እንደሆነ ይገምግሙ (>40%) ከዒላማ ውጪ የፓነል ትንታኔዎች ጋር. የዒላማ ምርጫን ለመጨመር የጎን ቅሪቶችን ይቀይሩ ወይም የፔፕታይድ ግንባታ ያሳጥሩ.
2. ማገድ እና ማትሪክስ ውጤት መቀነስ
ሰው ሠራሽ peptides ከፍ ያለ ፒአይ (>9.0) በፊዚዮሎጂ ፒኤች ላይ የተጣራ አወንታዊ ክፍያዎችን ይያዙ (7.4), በ MagPlex ዶቃዎች ላይ በኤሌክትሮስታቲክ የሚነዱ ልዩ ያልሆኑ ቀሪዎች አሉታዊ ቻርጅ ካደረጉ የካርቦክሳይል ቡድኖች ጋር እንዲተሳሰሩ ማድረግ.
- ሳሙና ማሟያ: ያካትቱ 0.05% ወደ 0.1% የሃይድሮፎቢክ መስተጋብርን ለመቀነስ Tween-20 ወይም Triton X-100 በመመርመሪያ እና በማጠብ ላይ.
- ፖሊ-አዮኒክ ማገጃዎች: አክል 10\ µg/ml heterophilic blocking reagents ወይም ዝቅተኛ-ሞለኪውላዊ ክብደት ዴክስትራን ሰልፌት በሰው ሴረም ወይም ፕላዝማ ማትሪክስ ናሙናዎች ውስጥ ion ዳራ ለመቀነስ.
ደረጃ 5: ባለብዙ ደረጃ የጥራት ቁጥጥር (ኪ.ሲ) & የመለኪያ ትክክለኛነት
ትክክለኛ የimmunoassay ልኬት የማመሳከሪያውን መደበኛ ቁሳቁስ ጥብቅ ፍፁም መመዘኛ ይጠይቃል. በትልቅ ክብደት ላይ ብቻ መተማመን ወደ ከፍተኛ የእርስ በርስ አለመግባባቶች ያመራል።.
አጠቃላይ የፔፕቲድስ ብዛት (1.0 mg ተመዘነ)
ውሃ & እርጥበት (5-15%)
ተቃራኒዎች: ቲኤፍኤ / አሲቴት (10-25%)
እውነተኛ የፔፕታይድ ቅዳሴ (~ 60-80% ትክክለኛ ንቁ ቅደም ተከተል)
1. የግዴታ Counterion ልወጣ (TFA ወደ Acetate / ኤች.ሲ.ኤል)
መደበኛ ጠንካራ-ደረጃ peptide ውህደት (SPSS) peptides እንደ trifluoroacetate ያስገኛል (ቲኤፍኤ) በ ምክንያት ጨው 0.1% የቲኤፍኤ አጠቃቀም በ RP-HPLC የሞባይል ደረጃዎች.
- TFA ድክመቶች: ቀሪ TFA (CF_3COO^-) የአካባቢ ምርመራ pH ይለውጣል, በሕዋስ ላይ የተመሰረቱ የማረጋገጫ ሙከራዎችን ያበላሻል, እና ከ15-30% ፔፕቲዲክ ያልሆነ የመከላከያ ክብደት ወደ ናሙናው ይጨምራል.
- የልወጣ ፕሮቶኮል: ion-exchange chromatography ወይም ተደጋጋሚ lyophilization ከ 10 mM HCl ወይም 1% ቆጣሪውን ወደ አሲቴት ወይም ሃይድሮክሎራይድ ጨው ለመለወጥ አሴቲክ አሲድ መፍትሄ. ቀሪ TFA ከዚህ በታች መሆኑን ለማረጋገጥ የመቀየሪያው ውጤታማነት በ ion chromatography ወይም capillary electrophoresis መረጋገጥ አለበት። 1.0%. በመጥቀስ በተቃዋሚ ልውውጥ ላይ በአቻ የተገመገመ ስምምነት, TFA ን ከባዮኬቲካል አሲቴት መለዋወጥ እንደገና ሊባዛ ለሚችል የበሽታ መከላከያ መለካት አስፈላጊ ነው።.
2. የተጣራ Peptide ይዘት (NPC) በአሚኖ አሲድ ትንተና (አአአ)
የ lyophilized peptides ግራቪሜትሪክ መመዘን የታሸገ እርጥበት እና መከላከያዎችን ያጠቃልላል. Chromatographic ንፅህና (RP-HPLC) በፔፕቲዲክ ዝርያዎች መካከል ያለውን አንጻራዊ ከፍተኛ ቦታ መቶኛ ይለካል, ግን ያደርጋል አይደለም ፔፕቲዲክ ያልሆነ ክብደትን ያንጸባርቁ.
ፍፁም የካሊብሬተር ክምችት ውህዶችን ለማቋቋም, ለካ የተጣራ Peptide ይዘት (NPC) የቁጥር አሚኖ አሲድ ትንታኔን በመጠቀም (አአአ). በ ውስጥ በዝርዝር እንደተገለጸው የተጣራ peptide ይዘት በአሚኖ አሲድ ትንተና በኩል መወሰን ፕሮቶኮል: አልኪሊቲዮፊኒየም ጨዎችን በመጠቀም ፔፕቲዶችን ወይም ፕሮቲኖችን የያዙ የሳይስቴይን ትክክለኛነት ማሻሻያ።
የተጣራ Peptide ይዘት (NPC %) = የተረጋገጡ የአሚኖ አሲዶች ብዛት/ጠቅላላ ጠቅላላ የተመዘነ ክብደት × 100
ለክምችት ዝግጅት ትክክለኛውን የፔፕታይድ ብዛትን በመጠቀም ያስሉ።:
እውነተኛ ገቢር ቅዳሴ = ጠቅላላ ቅዳሴ × (RP-HPLC ንፅህና %/100) × (NPC %/100) ሰው ሠራሽ ፖሊፔፕታይድ ጅምላ
3. ሎጥ-ወደ-ሎጥ የሚለቀቅ መስፈርት
ስለ እያንዳንዱ ሰው ሰራሽ የፔፕታይድ ደረጃዎች ከግምገማው ውህደት በፊት የሚከተሉትን የመልቀቂያ ገደቦች ማሟላት አለባቸው:
- ንጽህና (RP-HPLC): ≥ 95.0% ዋናው ጫፍ አካባቢ በ 214 nm እና 280 nm.
- ማንነት (HRMS/LC-MS): Monoisotopic mass በ ± ውስጥ ከንድፈ ሞለኪውላዊ ክብደት ጋር ይዛመዳል 0.5 እና.
- የተጣራ Peptide ይዘት (አአአ): በመተንተን የምስክር ወረቀት ላይ የተመጣጠነ የNPC መቶኛ (ኮአ).
- ቀሪ Counterion: ቀሪ TFA < 1.0\ ወ/ወ%.
- ዶቃ conjugation ዩኒፎርም: ውስጠ-ግምገማ CV < 5.0% በመላ 100 የዶቃ ንባቦችን መድገም; የሎተ-ወደ-ብዙ ተዳፋት ተለዋዋጭነት < 10.0% በመደበኛ ኩርባ መስመራዊ ክልል ላይ.
ከMOL ለውጦች ጋር የImmunoassay Standardizationን ማፋጠን
M Peptides አቅራቢ ለ multiplex Luminex assays ጠንካራ የፔፕታይድ ደረጃዎችን ማዳበር የላቀ ውህደት ኬሚስትሪ ያስፈልገዋል።, ልዩ ማሻሻያዎች, እና አጠቃላይ ትንታኔ QC. ከልዩ ሲዲኤምኦ ጋር መተባበር የውህደት ማነቆዎችን ያስወግዳል እና የምርመራ ደረጃ ቁሳቁሶችን ዋስትና ይሰጣል.
የ MOL ብጁ የፔፕታይድ ውህደት እና የማሻሻያ መድረክን ይለውጣል ለ immunoassay ገንቢዎች ሙሉ ከጫፍ እስከ ጫፍ መፍትሄዎችን ይሰጣል:
- 300+ ተግባራዊ ማሻሻያዎች: ጣቢያ-ተኮር N/C-terminal biotinylation, ሞኖ-የተበተኑ PEG ማያያዣዎች (PEG2–PEG24), የፍሎረሰንት ቀለም መለያ, እና ብጁ ምላሽ ሰጪ እጀታዎች.
- Ultra-Sterile ምርት: የፔፕታይድ ውህደት በክፍል ውስጥ ተፈጽሟል 100 የንጽሕና አከባቢዎች, እጅግ በጣም ዝቅተኛ የ endotoxin ደረጃዎችን ማረጋገጥ (<0.01 EU/mg) ለስሜታዊ ባዮአሳይስ.
- ጥብቅ የትንታኔ ማረጋገጫ: እያንዳንዱ ብጁ መመዘኛ ከሙሉ CoA ሰነድ ጋር ነው የሚቀርበው, ከፍተኛ-ጥራት LC-MS የጅምላ spectra ጨምሮ, ትንታኔ RP-HPLC chromatograms, AAA የተረጋገጠ የተጣራ Peptide ይዘት, እና የተረጋገጠ TFA-ወደ-አሲቴት ቆጣሪ ልውውጥ.
ቀደምት ደረጃ የባዮማርከር ፓነሎችን ማቋቋም ወይም የንግድ ብዝሃ-ምርመራ መሣሪያዎችን ማስተካከል, ከፍተኛ-ንፅህናን መጠቀም, ሙሉ ለሙሉ ተለይቶ የሚታወቅ ሰው ሰራሽ peptides የረጅም ጊዜ ምርመራን እንደገና መራባት እና ተገዢነትን ያረጋግጣል.
የፕሮቶኮል ማጠቃለያ ዝርዝር
- 8-15 የአሚኖ አሲድ ኮር ኤፒቶፕ ይምረጡ; በማጣመር ተርሚኑ ላይ ሃይድሮፊል PEG2/PEG4 ማገናኛን ይጨምሩ.
- ጣቢያ-ተኮር ባዮቲንላይዜሽን ወይም ነጠላ ኤን-ተርሚናል የመጀመሪያ ደረጃ አሚንን ያካትቱ.
- ከቲኤፍኤ ወደ አሲቴት ጨው የቆጣሪ ለውጥን ያከናውኑ (ቀሪ TFA <1.0%).
- የተጣራ Peptide ይዘትን ይወስኑ (NPC) በ AAA በኩል; በዚህ መሠረት የካሊብሬተር ክምችት ዝግጅትን ያስተካክሉ.
- የMagPlex COOH ዶቃዎችን በ ውስጥ ያግብሩ 100 mM MES (ፒኤች 6.0) ትኩስ EDC/Sulfo-NHS በመጠቀም.
- ከአሚን-ነጻ PBS ውስጥ ጥንዶች peptide (ፒኤች 7.2-7.4); በኤታኖላሚን ወይም በትሪስ/ኬሴይን ያልተነኩ ኢስተርን ያጥፉ.
- ባለ 5×5 ማትሪክስ ስክሪን በመጠቀም ተሻጋሪ ምላሽን ያረጋግጡ (ከዒላማ ውጭ ምልክት <1.5%).
