ल्यूमिनेक्स मल्टीप्लेक्स इम्यूनोएसे के लिए पेप्टाइड मानक डिजाइन करना: एक लैब-तैयार प्रोटोकॉल
मल्टीप्लेक्स मनका-आधारित निलंबन सरणियाँ, जैसे ल्यूमिनेक्स एक्सएमएपी और मैगप्लेक्स प्रौद्योगिकियां, बहु-विश्लेषण पैनलों में सटीक मात्रात्मक डेटा देने के लिए अत्यधिक विशिष्ट अंशशोधकों पर भरोसा करें. जबकि पुनः संयोजक पूर्ण-लंबाई वाले प्रोटीन ऐतिहासिक रूप से मानक अंशशोधक के रूप में कार्य करते हैं, सिंथेटिक पेप्टाइड्स एपिटोप-विशिष्ट मात्रा निर्धारण के लिए स्वर्ण मानक के रूप में उभरे हैं, बायोमार्कर सत्यापन, और उच्च-थ्रूपुट एंटीबॉडी प्रोफाइलिंग. सिंथेटिक पेप्टाइड्स परिभाषित स्टोइकोमेट्री प्रदान करते हैं, न्यूनतम लॉट-टू-लॉट संरचनात्मक भिन्नता, और लागत प्रभावी मापनीयता.
तथापि, एक कच्चे पेप्टाइड अनुक्रम को एक मान्य इम्यूनोएसे मानक में अनुवाद करने के लिए कठोर रासायनिक डिजाइन और बायोकॉन्जुगेशन अनुकूलन की आवश्यकता होती है. छोटे सिंथेटिक पेप्टाइड्स (<30 अमीनो अम्ल) सीधे कार्बोक्सिलेटेड माइक्रोस्फीयर पर स्थिर होने पर अक्सर एपिटोप मास्किंग प्रदर्शित होती है, गैर-विशिष्ट हाइड्रोफोबिक सोखना, या काउंटरियन मास विरूपण के कारण गलत ग्रेविमेट्रिक एकाग्रता अंशांकन.
यह बेंच-रेडी प्रोटोकॉल डिजाइनिंग के लिए 5-चरण पद्धति की रूपरेखा तैयार करता है, बदलाव, युग्मन, और सत्यापन कर रहा है ल्यूमिनेक्स मल्टीप्लेक्स इम्यूनोएसेज़ के लिए पेप्टाइड मानक, अधिकतम एपिटोप पहुंच सुनिश्चित करना, न्यूनतम क्रॉस-रिएक्टिविटी, और सख्त परख प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्यता. डाइपेप्टाइड थोक
चरण 1: अनुक्रम चयन और लिंकर आर्किटेक्चर
छोटे सिंथेटिक पेप्टाइड्स को सीधे पॉलीस्टायरीन या चुंबकीय मनका सतहों पर स्थिर करने से अक्सर स्टेरिक बाधा उत्पन्न होती है, जहां बीड मैट्रिक्स कुंजी बाइंडिंग अवशेषों तक एंटीबॉडी की पहुंच को अवरुद्ध करता है. इष्टतम अनुक्रम डिज़ाइन भौतिक स्थिरता को संतुलित करता है, गठनात्मक लचीलापन, और साइट-विशिष्ट प्रस्तुति.
1. एपिटोप मैपिंग और अनुक्रम लंबाई
- न्यूनतम एपिटोप पहचान: मूल रैखिक या सतत गठनात्मक बंधन रूपांकनों को पहचानें (आमतौर पर 8-15 अमीनो एसिड).
- फ़्लैंकिंग अवशेष: 2-4 मूल निवासी एन को बनाए रखें- और स्थानीय माध्यमिक संरचना और आयनिक घुलनशीलता को संरक्षित करने के लिए सी-टर्मिनल फ़्लैंकिंग अमीनो एसिड.
- हाइड्रोफोबिसिटी शमन: हाइड्रोपेथिसिटी के भव्य औसत की गणना करें (रस) अंक. उच्च हाइड्रोफोबिक अवशेषों वाले अनुक्रम (टीआरपी, पीएचई, लियू, साथ) हाइड्रोफोबिक पॉलीस्टाइरीन बीड कोर पर ढहने की प्रवृत्ति होती है, उच्च गैर-विशिष्ट बंधन की ओर अग्रसर (एन एस बी). घुलनशील टैग शामिल करें (जैसे कि गैर-एपिटोप टर्मिनी में लिस-लिस या ग्लू-ग्लू परिवर्धन) यदि आवश्यक है.
2. स्पेसर और लचीले लिंकर
मनका हाइड्रोडायनामिक सीमा परत से परे एपिटोप को प्रक्षेपित करना, कार्यात्मक युग्मन हैंडल और लक्ष्य अनुक्रम के बीच एक हाइड्रोफिलिक स्पेसर डालें.
- खूंटी स्पेसर्स: पॉलीथीन ग्लाइकोल लिंकर्स (PEG2, PEG4, या PEG12) कठोर हाइड्रोकार्बन श्रृंखलाओं की तुलना में बेहतर जलीय घुलनशीलता और शून्य इम्युनोजेनेसिटी प्रदान करते हैं.
- अमीनो-हेक्सानोइक एसिड (आह): 1-2 एनएम भौतिक ऑफसेट की आवश्यकता वाले मध्यम हाइड्रोफिलिक अनुक्रमों के लिए उपयुक्त.
टिप के लिए: प्रतिक्रियाशील युग्मन साइट के बीच हमेशा लचीला पीईजी स्पेसर रखें (जैसे, एन-टर्मिनल एमाइन या टर्मिनल Cys) और एपीटोप. स्पेसर के बिना सीधे युग्मन से बीड कार्बोक्सिल सतह द्वारा स्टेरिक परिरक्षण के कारण एंटीबॉडी बाइंडिंग एफ़िनिटी को 40-70% तक कम किया जा सकता है।.
चरण 2: साइट-विशिष्ट संशोधन और लेबलिंग रसायन विज्ञान
यादृच्छिक या गैर-दिशात्मक युग्मन एपिटोप संरचना को बदल देता है और बैच-टू-बैच अभिविन्यास परिवर्तनशीलता का कारण बनता है. साइट-विशिष्ट रासायनिक संशोधन प्रत्येक सूक्ष्ममंडल क्षेत्र में एक समान स्थानिक प्रस्तुति सुनिश्चित करता है.
| ओरिएंटेशनल स्थिरीकरण विकल्प | विवरण |
|---|---|
| विकल्प ए | N- टर्मिनस / लिस अमीन पीईजी4 स्पेसर → ईडीसी/एस-एनएचएस एमाइड बॉन्ड → सीओओएच-मैगप्लेक्स बीड |
| विकल्प बी | टर्मिनल बायोटिन टैग PEG4 स्पेसर → स्ट्रेप्टाविडिन कैप्चर → एविडिन-मैगप्लेक्स बीड |
| विकल्प सी | टर्मिनल सिस्टीन थियोल मालेमाइड हैंडल → थियोथर लिंकेज → अमीन-मैगप्लेक्स बीड |
1. बायोटिनाइलेशन बनाम. प्रत्यक्ष अमीन युग्मन
- टर्मिनल बायोटिनाइलेशन: एन-टर्मिनल बायोटिन या लिस को शामिल करना(बायोटिन) PEG4 लिंकर के माध्यम से तेजी से अनुमति मिलती है, स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित मैगप्लेक्स माइक्रोस्फीयर पर उच्च-आत्मीयता स्थिरीकरण (के डी ≈ 10^{-14} एम). यह परख सेटअप के दौरान ऑन-बीड कार्बोडायमाइड रसायन विज्ञान की आवश्यकता को समाप्त करता है.
- प्रत्यक्ष अमीन युग्मन: यदि कार्बोक्सिलेटेड का उपयोग कर रहे हैं (कूह) मैगप्लेक्स माइक्रोस्फीयर, सुनिश्चित करें कि इसमें केवल पेप्टाइड शामिल है एक प्राथमिक अमीन (एन-टर्मिनस). एपिटोप के भीतर आंतरिक लाइसिन अवशेषों को संश्लेषण के दौरान प्रतिस्थापित या संरक्षित किया जाना चाहिए ताकि विषम बहु-बिंदु लगाव को रोका जा सके जो एंटीबॉडी पहचान को बाधित करता है.
2. मल्टीप्लेक्स गुणवत्ता नियंत्रण के लिए फ्लोरोसेंट टैगिंग
रिपोर्टर चैनलों को मान्य करते समय या बीड लोडिंग घनत्व को ट्रैक करते समय, ऑर्थोगोनल फ्लोरोफोरस (जैसे, एलेक्सा फ्लोर 488 या FITC) गैर-प्रतिस्पर्धी टर्मिनल लाइसिन साइड चेन से संयुग्मित किया जा सकता है.
- वर्णक्रमीय अनुकूलता: सुनिश्चित करें कि टैग उत्तेजना/उत्सर्जन स्पेक्ट्रा आंतरिक ल्यूमिनेक्स वर्गीकरण लेजर के साथ ओवरलैप न हो (लाल/अवरक्त रंग 658 एनएम और 712 एनएम, या ग्रीन रिपोर्टर चैनल पर 525 इंटेलिफ्लेक्स सिस्टम पर एनएम).
चरण 3: ल्यूमिनेक्स मैगप्लेक्स बीड कपलिंग प्रोटोकॉल
कार्बोक्सिलेटेड एक्सएमएपी माइक्रोस्फीयर (मैगप्लेक्स COOH) सतह कार्बोक्सिल समूह शामिल हैं (~10⁷ COOH/मनका) जो 1-एथिल-3- का उपयोग करके दो-चरणीय कार्बोडायमाइड रसायन विज्ञान के माध्यम से प्राथमिक अमाइन के साथ प्रतिक्रिया करता है।(3-डाइमिथाइलैमिनोप्रोपाइल)कार्बोडायमाइड (ईडीसी) और एन-हाइड्रोक्सीसल्फोस्यूसिनिमाइड (Sulfo-एन एच एस).
| प्रोटोकॉल चरण | बफर / अभिकर्मक | प्रतिक्रिया पैरामीटर्स | मुख्य उद्देश्य |
|---|---|---|---|
| 1. मनका धोना | 100 एमएम एमईएस, पीएच 6.0 | 2.5 × 10⁶ मोती, भंवर & चुंबकीय पृथक्करण | भंडारण परिरक्षकों को हटा दें और सतह को संतुलित करें |
| 2. COOH सक्रियण | 50 एमजी/एमएल ईडीसी + 50 एमईएस में एमजी/एमएल सल्फो-एनएचएस | सेते 20 कोमल घुमाव के साथ आरटी पर मिनट | COOH को स्थिर में बदलें, अमीन-प्रतिक्रियाशील सल्फो-एनएचएस एस्टर |
| 3. एक्टिवेशन वॉश | 50 एमएम एमईएस, पीएच 6.0 | सक्रियण बफर के साथ 2× धोएं | अप्रयुक्त ईडीसी को हटा दें, यूरिया उपोत्पाद, और अतिरिक्त सल्फो-एनएचएस |
| 4. पेप्टाइड युग्मन | पीबीएस (पीएच 7.2-7.4) + 10–20\ µg peptide | सेते 2 h RT पर या रात भर 4°C पर | प्राथमिक ऐमीनों के साथ सहसंयोजक एमाइड आबंध बनाते हैं |
| 5. शमन | 1 एम इथेनॉलमाइन (पीएच 9.0) या 50 एमएम ट्रिस (पीएच 8.0) | सेते 30 आरटी पर मिनट | गैर-विशिष्ट बंधन को रोकने के लिए अप्रतिक्रियाशील एनएचएस-एस्टर को हाइड्रोलाइज़ करें |
| 6. ब्लॉक कर रहा है / भंडारण | पीबीएस, 1% बीएसए, 0.05% सोडियम एज़ाइड, पीएच 7.4 | 2-8°C पर अंधेरे में रखें | दीर्घकालिक भंडारण के लिए संयुग्मित माइक्रोस्फीयर को स्थिर करें |
महत्वपूर्ण युग्मन निष्पादन दिशानिर्देश
- सक्रियण बफ़र नियंत्रण: कार्बोक्सिल सक्रियण करें पीएच 6.0-6.3 एमईएस बफर में. पीएच पर ईडीसी दक्षता काफी कम हो जाती है > 7.0.
- ताजा अभिकर्मक तैयारी: ईडीसी और सल्फो-एनएचएस हीड्रोस्कोपिक हैं और जलीय घोल में तेजी से हाइड्रोलाइज होते हैं. जोड़ने से तुरंत पहले सूखे एलिकोट्स को घोलें; पुनर्गठित स्टॉक समाधानों को संग्रहित न करें.
- अमीन-मुक्त युग्मन चरण: चरण के दौरान 4, युग्मन बफर प्राथमिक एमाइन या न्यूक्लियोफाइल से मुक्त होना चाहिए. ट्रिस से बचें, ग्लाइसिन, या सोडियम एजाइड युग्मन बफ़र में, क्योंकि प्रतिस्पर्धी न्यूक्लियोफाइल सक्रिय एनएचएस-एस्टर का उपभोग करेंगे और पेप्टाइड युग्मन उपज को कम करेंगे.
⚠️ चेतावनी: कभी भी बीएसए का परिचय न दें, सीरम, या कदम से पहले जिलेटिन 5. युग्मन चरण के दौरान प्रोटीन अवरोधक जोड़ने से मोतियों में भारी प्रोटीन संयुग्मन होता है, सिंथेटिक पेप्टाइड मानक को पूरी तरह से छुपाना.
चरण 4: मल्टीप्लेक्स क्रॉस-रिएक्टिविटी & गैर-विशिष्ट बाइंडिंग रोकथाम
मल्टीप्लेक्स ल्यूमिनेक्स पैनल में (जैसे, 10-प्लेक्स से 50-प्लेक्स), क्रॉस-रिएक्टिविटी दो अलग-अलग इंटरफेस पर हो सकती है: एंटीबॉडी-से-गैर-लक्ष्य-पेप्टाइड बंधन और पेप्टाइड-टू-बीड गैर-विशिष्ट सोखना. सिंथेटिक पेप्टाइड्स निर्माता
1. मैट्रिक्स क्रॉस-रिएक्टिविटी स्क्रीनिंग (5×5 चेकरबोर्ड सत्यापन)
मल्टीप्लेक्स पैनल को लॉक करने से पहले, पूर्ण एकल-विश्लेषण बनाम निष्पादित करें. मल्टीप्लेक्स मैट्रिक्स स्क्रीनिंग:
- व्यक्तिगत प्राथमिक पहचान एंटीबॉडी को व्यक्तिगत रूप से सभी स्थिर पेप्टाइड मनका क्षेत्रों के खिलाफ ऊष्मायन किया जाना चाहिए.
- गैर-लक्ष्य मनका क्षेत्रों पर सिग्नल स्पिलओवर से अधिक नहीं होना चाहिए 1.5% विशिष्ट लक्ष्य संकेत का अधिकतम अंशशोधक एकाग्रता पर (बी अधिकतम).
- यदि क्रॉस-रिएक्टिविटी होती है, मूल्यांकन करें कि क्या अनुक्रम रैखिक समरूपता साझा करता है (>40%) ऑफ-टार्गेट पैनल विश्लेषणों के साथ. लक्ष्य चयनात्मकता बढ़ाने के लिए फ़्लैंकिंग अवशेषों को संशोधित करें या पेप्टाइड निर्माण को छोटा करें.
2. अवरोधन और मैट्रिक्स प्रभाव शमन
उच्च पीआई के साथ सिंथेटिक पेप्टाइड्स (>9.0) शारीरिक pH पर शुद्ध धनात्मक आवेश ले जाते हैं (7.4), मैगप्लेक्स मोतियों पर अवशिष्ट नकारात्मक रूप से चार्ज किए गए कार्बोक्सिल समूहों के लिए इलेक्ट्रोस्टैटिक रूप से संचालित गैर-विशिष्ट बंधन का कारण बनता है.
- डिटर्जेंट अनुपूरक: शामिल करना 0.05% को 0.1% हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन को कम करने के लिए परख और वॉश बफ़र्स में ट्वीन-20 या ट्राइटन एक्स-100.
- पॉली-आयनिक अवरोधक: जोड़ना 10\ मानव सीरम या प्लाज्मा मैट्रिक्स नमूनों में आयनिक पृष्ठभूमि को कम करने के लिए µg/mL हेटरोफिलिक अवरोधक अभिकर्मक या कम आणविक भार डेक्सट्रान सल्फेट.
चरण 5: बहु-स्तरीय गुणवत्ता नियंत्रण (क्यूसी) & अंशांकन सटीकता
सटीक इम्यूनोएसे अंशांकन के लिए संदर्भ मानक सामग्री की सख्त पूर्ण मात्रा की आवश्यकता होती है. केवल सकल तौले गए द्रव्यमान पर निर्भर रहने से बड़ी अंतर-लॉट विसंगतियां पैदा होती हैं.
सकल पेप्टाइड्स मास (1.0 मिलीग्राम तौला गया)
पानी & नमी (5-15%)
प्रतिवाद: टीएफए / एसीटेट (10-25%)
सच्चा पेप्टाइड मास (~60-80% वास्तविक सक्रिय अनुक्रम)
1. अनिवार्य प्रतिवाद रूपांतरण (टीएफए से एसीटेट / एचसीएल)
मानक ठोस-चरण पेप्टाइड संश्लेषण (एसपीएसएस) ट्राइफ्लुओरोएसेटेट के रूप में पेप्टाइड्स उत्पन्न करता है (टीएफए) लवण के कारण 0.1% आरपी-एचपीएलसी मोबाइल चरणों में टीएफए का उपयोग.
- टीएफए कमियां: अवशिष्ट टीएफए (CF_3COO^-) स्थानीय परख pH को बदल देता है, सेल-आधारित सत्यापन परख को बाधित करता है, और नमूने में 15-30% गैर-पेप्टिडिक काउंटरियन वजन जोड़ता है.
- रूपांतरण प्रोटोकॉल: आयन-एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी या बार-बार लियोफिलाइजेशन करें 10 एमएम एचसीएल या 1% काउंटरियन को एसीटेट या हाइड्रोक्लोराइड लवण में परिवर्तित करने के लिए एसिटिक एसिड समाधान. यह सुनिश्चित करने के लिए कि अवशिष्ट टीएफए नीचे है, रूपांतरण दक्षता को आयन क्रोमैटोग्राफी या केशिका वैद्युतकणसंचलन द्वारा सत्यापित किया जाना चाहिए 1.0%. का हवाला देते हुए काउंटरियन एक्सचेंज पर सहकर्मी-समीक्षित सहमति, बायोकम्पैटिबल एसीटेट के लिए टीएफए का आदान-प्रदान प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य इम्यूनोएसे अंशांकन के लिए आवश्यक है.
2. नेट पेप्टाइड सामग्री (एनपीसी) अमीनो एसिड विश्लेषण के माध्यम से (एएए)
लियोफिलाइज्ड पेप्टाइड्स के ग्रेविमेट्रिक वजन में फंसी हुई नमी और काउंटर्स शामिल हैं. क्रोमैटोग्राफिक शुद्धता (आरपी-एचपीएलसी) पेप्टिडिक प्रजातियों के बीच सापेक्ष शिखर क्षेत्र प्रतिशत को मापता है, लेकिन करता है नहीं गैर-पेप्टिडिक द्रव्यमान को प्रतिबिंबित करें.
पूर्ण अंशशोधक स्टॉक सांद्रता स्थापित करने के लिए, उपाय नेट पेप्टाइड सामग्री (एनपीसी) मात्रात्मक अमीनो एसिड विश्लेषण का उपयोग करना (एएए). जैसा कि विवरण में बताया गया है अमीनो एसिड विश्लेषण के माध्यम से शुद्ध पेप्टाइड सामग्री निर्धारण शिष्टाचार: एल्काइलथियोफेनियम साल्ट का उपयोग करके पेप्टाइड्स या प्रोटीन युक्त सिस्टीन का सटीक संशोधन
नेट पेप्टाइड सामग्री (एनपीसी %) = सत्यापित अमीनो एसिड का द्रव्यमान/कुल सकल वजन × 100
का उपयोग करके स्टॉक तैयार करने के लिए वास्तविक सक्रिय पेप्टाइड द्रव्यमान की गणना करें:
वास्तविक सक्रिय द्रव्यमान = सकल द्रव्यमान × (आरपी-एचपीएलसी शुद्धता %/100) × (एनपीसी %/100) सिंथेटिक पॉलीपेप्टाइड थोक
3. लॉट-टू-लॉट रिलीज मानदंड
के बारे में सिंथेटिक पेप्टाइड मानकों के प्रत्येक बैच को परख एकीकरण से पहले निम्नलिखित रिलीज थ्रेशोल्ड को पूरा करना चाहिए:
- पवित्रता (आरपी-एचपीएलसी): ≥ 95.0% मुख्य शिखर क्षेत्र 214 एनएम और 280 एनएम.
- पहचान (एचआरएमएस/एलसी-एमएस): मोनोआइसोटोपिक द्रव्यमान ± के भीतर सैद्धांतिक आणविक भार से मेल खाता है 0.5 और.
- नेट पेप्टाइड सामग्री (एएए): विश्लेषण प्रमाणपत्र पर मात्राबद्ध एनपीसी प्रतिशत प्रदान किया गया (सीओए).
- अवशिष्ट प्रतिवाद: अवशिष्ट टीएफए < 1.0\ w/w%.
- मनका संयुग्मन एकरूपता: इंट्रा-परख सीवी < 5.0% आर-पार 100 मनका रीडिंग को दोहराएँ; लॉट-टू-लॉट ढलान परिवर्तनशीलता < 10.0% मानक वक्र रैखिक सीमा पर.
एमओएल परिवर्तनों के साथ इम्यूनोएसे मानकीकरण में तेजी लाना
एम पेप्टाइड्स आपूर्तिकर्ता मल्टीप्लेक्स ल्यूमिनेक्स परख के लिए मजबूत पेप्टाइड मानकों को विकसित करने के लिए उन्नत संश्लेषण रसायन विज्ञान की आवश्यकता होती है, विशेष संशोधन, और व्यापक विश्लेषणात्मक क्यूसी. एक विशेष सीडीएमओ के साथ साझेदारी करने से संश्लेषण की बाधाएं दूर हो जाती हैं और परख-ग्रेड सामग्री की गारंटी मिलती है.
The एमओएल कस्टम पेप्टाइड संश्लेषण और संशोधन प्लेटफ़ॉर्म को बदलता है इम्यूनोएसे डेवलपर्स के लिए संपूर्ण एंड-टू-एंड समाधान प्रदान करता है:
- 300+ कार्यात्मक संशोधन: साइट-विशिष्ट एन/सी-टर्मिनल बायोटिनाइलेशन, मोनो-बिखरे हुए पीईजी लिंकर्स (पीईजी2-पीईजी24), फ्लोरोसेंट डाई लेबलिंग, और कस्टम प्रतिक्रियाशील हैंडल.
- अल्ट्रा-स्टेराइल उत्पादन: पेप्टाइड संश्लेषण कक्षा के भीतर क्रियान्वित किया गया 100 साफ़ कमरे का वातावरण, अल्ट्रा-लो एंडोटॉक्सिन स्तर सुनिश्चित करना (<0.01 ईयू/एमजी) संवेदनशील बायोएसेज़ के लिए.
- कठोर विश्लेषणात्मक सत्यापन: प्रत्येक कस्टम मानक पूर्ण सीओए दस्तावेज़ के साथ वितरित किया जाता है, उच्च-रिज़ॉल्यूशन एलसी-एमएस मास स्पेक्ट्रा सहित, विश्लेषणात्मक आरपी-एचपीएलसी क्रोमैटोग्राम, एएए-प्रमाणित नेट पेप्टाइड सामग्री, और सत्यापित टीएफए-टू-एसीटेट काउंटरियन एक्सचेंज.
चाहे प्रारंभिक चरण के बायोमार्कर पैनल स्थापित करना हो या वाणिज्यिक मल्टीप्लेक्स डायग्नोस्टिक किट का विस्तार करना हो, उच्च शुद्धता का लाभ उठाना, पूरी तरह से विशेषता वाले सिंथेटिक पेप्टाइड्स दीर्घकालिक परख प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्यता और अनुपालन सुनिश्चित करते हैं.
सारांश प्रोटोकॉल चेकलिस्ट
- 8-15 अमीनो एसिड कोर एपिटोप का चयन करें; कपलिंग टर्मिनस पर हाइड्रोफिलिक PEG2/PEG4 लिंकर जोड़ें.
- साइट-विशिष्ट बायोटिनाइलेशन या एकल एन-टर्मिनल प्राथमिक अमीन शामिल करें.
- टीएफए से एसीटेट नमक में काउंटरियन रूपांतरण करें (अवशिष्ट टीएफए <1.0%).
- नेट पेप्टाइड सामग्री निर्धारित करें (एनपीसी) एएए के माध्यम से; अंशशोधक स्टॉक की तैयारी को तदनुसार समायोजित करें.
- MagPlex COOH मोतियों को सक्रिय करें 100 एमएम एमईएस (पीएच 6.0) ताजा ईडीसी/सल्फो-एनएचएस का उपयोग करना.
- अमीन मुक्त पीबीएस में युगल पेप्टाइड (पीएच 7.2-7.4); प्रतिक्रिया न किए गए एस्टर को इथेनॉलमाइन या ट्रिस/केसीन से बुझाएं.
- 5×5 मैट्रिक्स स्क्रीन का उपयोग करके क्रॉस-रिएक्टिविटी को मान्य करें (ऑफ-टारगेट सिग्नल <1.5%).
