ප්‍රෝටීන් පිරිහීම පිරික්සීමට වඩා හොඳ පෙප්ටයිඩ අවශ්‍ය වන්නේ ඇයි? & ප්රෝටීන් ප්රතික්රියාකාරක

Degradation-Screening Reagent එකක් ඇත්ත වශයෙන්ම කළ යුතු දේ

QC ඇගයීමට පෙර, එය සම්බන්ධ වන ප්‍රතික්‍රියාකාරක පන්ති වෙන් කිරීමට උපකාරී වේ. ප්‍රතිදීප්ත වාර්තාකරුවන් වෙන්කර හඳුනා ගැනීමට සම්මත ප්‍රෝටෝමික් සහ රසායනික-පරීක්ෂණ මාර්ගෝපදේශ, ක්‍රියාකාරකම් මත පදනම් වූ පරීක්ෂණ, සහ බැඳීම්-පොහොසත් කිරීමේ ප්රතික්රියාකාරක, එක් එක් පරිවර්තනය ubiquitin-proteasome පද්ධතිය (UPS) සෛල තුළ මැනිය හැකි කියවීමකට ක්රියාකාරිත්වය, lysates, හෝ සෛල රහිත ප්රතික්රියා.

• ප්රතිදීප්ත ලේබල් ඔබට ක්‍රියාකාරී එන්සයිම දෘශ්‍යමාන කිරීමට හෝ ප්‍රමාණ කිරීමට ඉඩ දෙන්න, proteasome උප ඒකක, හෝ in-gel fluorescence මගින් වාර්තාකරු උපස්ථර, අන්වීක්ෂය, හෝ සංඥා වාර්තාකරුවන් ලාභ/අලාභ.

  

• බයෝටින් ලේබල් පොහොසත් කිරීමේ මෙවලම් වේ, ක්රියාකාරී deubiquitinases අල්ලා ගැනීම (DUBs) හෝ ප්‍රතිශක්තිකරණ හෝ ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂය හඳුනාගැනීමට පෙර ස්ට්‍රෙප්ටාවිඩින් පුල්-ඩවුන් මගින් වෙනස් කරන ලද ප්‍රෝටීන.

• Ubiquitin සහ NEDD8-mimetic probes සහ fluorogenic හෝ FRET උපස්ථර ubiquitin-like modifier වලින් ubiquitin වෙන්කර හඳුනාගත යුතු එන්සයිම සහ ligases ප්‍රශ්න කරයි - ඉලක්කගත පිරිහීමේ සිදුවීමක් සැබවින්ම සිදු වූවාද යන්න තීරණය කරන රසායන විද්‍යාව.

  

• පිරිහීමේ උපස්ථර සංයෝග-ධාවනය කරන හෝ ප්‍රෝටිසෝම මත යැපෙන අලාභයක් ප්‍රමාණාත්මක සංඥා වෙනසක් ඇති කරන පරිදි අස්ථායීකරන හෝ පරිහානිය අනුපිළිවෙලක් රැගෙන යන්න.

මෙම සෑම භූමිකාවක්ම කුඩා ව්‍යුහාත්මක විස්තරයක් මත ගනුදෙනු කරයි: කුමන අවශේෂ ලේබල් කර ඇත, සංශෝධනයක් ඇති තැන, isopeptide හෝ oxyester සම්බන්ධයක් නිවැරදිද යන්න, සහ යුධ ශීර්ෂය නිවැරදි පර්යන්තයේ තිබේද යන්න. “95% සංශුද්ධතාවය” ප්‍රමුඛ ඩෙස්-ඇමිඩේටඩ් හෝ මකාදැමීමේ සමාවයවිකයක් සඟවන ප්‍රතික්‍රියාකාරකයකට බන්ධනය වෙනස් කළ හැකිය., ස්ථාවරත්වය, හෝ සම්පූර්ණ තිරයක අර්ථ නිරූපණය නැවත හැඩගැස්වීමට තරම් පෙනෙන පරිහානිය අනුපාතය.

ලේබල් කරන ලද පෙප්ටයිඩ සඳහා ලේබල-විශේෂිත තහවුරු කිරීමක් අවශ්‍ය වේ

ප්‍රතිදීප්ත හෝ බයෝටින් ටැග් එකක් නිෂ්ක්‍රීය ඇඩෝනයක් නොවේ. සංයෝජන වර්ණදේහයේ රඳවා ගැනීමේ කාලය සහ අයනීකරණය යන දෙකම වෙනස් කරයි, සහ එය පුරෝකථනය කළ හැකි ස්කන්ධ මාරුවක් හඳුන්වා දෙයි - නමුත් අපේක්ෂිත විශේෂය සෑදෙන්නේ නම් පමණි.

මෙහි ප්‍රතික්‍රියාකාරක ගුණය යන්නෙන් අදහස් වන්නේ තහවුරු කිරීමයි ලේබල් කර ඇත විශේෂ, මව් පෙප්ටයිඩ පමණක් නොවේ. එය සාමාන්යයෙන් අවශ්ය වේ:

• පෙප්ටයිඩ සංශ්ලේෂණය අපේක්ෂිත ස්කන්ධ මාරුව හරහා එකතු කරන ලද ලේබලයේ ස්කන්ධ වර්ණාවලිමිතික සත්‍යාපනය;

• LC-MS හෝ UPLC මගින් ලේබල් කරන ලද අණු elutes සහ අයනීකරනය කරන බව තහවුරු කිරීමට පරීක්‍ෂා කරයි., අධිපති විශේෂ;

• ලේබලය සඳහා වෙනම අනන්‍යතා වාර්තා කිරීම, මක්නිසාද යත් එහි වෙනස් වූ හැසිරීම් සම-ප්‍රත්‍යක්ෂ අතුරු නිෂ්පාදන වසන් කළ හැකි බැවිනි.

බයෝටින් සඳහා, සැලකිලිමත් වීම පොහොසත් කිරීමේ විශ්වාසවන්තභාවයයි: අර්ධ වශයෙන් ලේබල් කරන ලද හෝ වැරදි-බයෝටයිනයිලේටඩ් ගොඩක් ස්ට්‍රෙප්ටාවිඩින් වෙනස් ලෙස බැඳිය හැකි අතර වැරදි ප්‍රෝටීන කට්ටලයක් පහළට ඇද දැමිය හැකිය.. ෆ්ලෝරෝෆෝර් සඳහා, අසාර්ථක මාදිලිය වෙනස් නමුත් සමානව කඩාකප්පල් වේ - විශ්ලේෂණ තරංග ආයාමයේදී ස්වයංක්‍රීය ප්‍රතිදීප්ත වන අපිරිසිදුකම අව්‍යාජ සංඥාව අනුකරණය කරන අතර පහර අනුපාත වැඩි කරයි. නිශ්චිත ලේබල් කළ ස්කන්ධය සහ අවසාන සංයුජයේ ක්‍රොමැටෝග්‍රෑම් වාර්තා කරන ලෙස පරීක්‍ෂණ විද්‍යාගාර වැඩි වැඩියෙන් විකුණුම්කරුවන්ගෙන් ඉල්ලා සිටී., අනුපිළිවෙල සංශුද්ධතාවය පමණක් නොවේ.

විශ්ලේෂණය-විශේෂිත වෙනස් කිරීම් සත්‍යාපනය කළ යුතුය, උපකල්පනය කර නැත

දිරාපත්වීමේ ප්‍රතික්‍රියාකාරක බොහෝ විට සරල පෙප්ටයිඩ නොවේ. ඒවා ubiquitin-mimetic හෝ NEDD8-mimetic මූලද්‍රව්‍ය දරයි, ඉලෙක්ට්රොෆිලික් යුධ හිස්, affinity handles, සම්බන්ධ කරන්නන්, සහ FRET හෝ fluorogenic යුගල. සාක්ෂි භාරය වන්නේ එය තහවුරු කිරීමයි අදහස් කර ඇත ව්‍යුහය ගොඩට ආධිපත්‍යය දරන අතර අනපේක්ෂිත සමාවයවිකයක් නොමැත, කප්පාදුව, හෝ අතුරු නිෂ්පාදනයක් විශ්ලේෂණය අවුල් කරන මට්ටමකට එකතු වී ඇත.

degraders හි කුඩා අණු පැත්ත සඳහා, විශ්ලේෂණ භාවිතය දැනටමත් පැහැදිලිය: ශක්තිමත් පැකේජයක් කාබනික සංශුද්ධතාවය සඳහා LC-MS හෝ HPLC භාවිතා කරයි, ව්‍යුහය සහ ස්කන්ධ ශේෂය සඳහා NMR හෝ qNMR, සින්ක් සම්බන්ධීකරණය නිවාදැමිය හැකි ස්ටීරියෝසෙන්ටර් එපීමරීකරණය සහ ට්‍රේස්-ලෝහ දූෂක අල්ලා ගැනීම සඳහා බොහෝ විට චිරල් හෝ ලෝහ විශ්ලේෂණය. එකම තිර පෝෂණය කරන පෙප්ටයිඩ සහ ප්‍රෝටීන් ප්‍රතික්‍රියාකාරක එකම විනයකට සුදුසුයි - වෙනස් කිරීමේ අඩවියේ සත්‍යාපනය, සම්බන්ධතාවය සහ පර්යන්තය තහවුරු කිරීම, සහ ප්‍රමුඛ අපිරිසිදුකම ජීව විද්‍යාත්මක කියවීමට බාධා කළ හැකිද යන්න පිළිබඳ පැහැදිලිකම.

අනුපිළිවෙල විශ්වාසවන්තභාවය සාකච්ඡා කළ නොහැක

Screening libraries සහ probe sets සාමාන්‍යයෙන් ඇණවුම් කරනු ලබන්නේ degron එකක් කේතනය කරන නිශ්චිත ප්‍රාථමික ව්‍යුහයකට එරෙහිවය., හඳුනාගැනීමේ චේතනාවක්, එන්සයිම කැපුම් අඩවියක්, හෝ පොස්පරීකරණය මත යැපෙන සංඥාවක්. අනුක්‍රමික විශ්වාසවන්තභාවය යන්නෙන් අදහස් වන්නේ ව්‍යුහය ඇත්ත වශයෙන්ම නැව්ගත කර ඇති බවයි - මකාදැමීමකින් තොරව, ආදේශකයක් නැත, වැරදි සංස්ථාගත කිරීමක් නැත, සහ නිවැරදි එන්- සහ C-termini.

විශ්වාසවන්තභාවය යනු පර්යේෂණ ශ්‍රේණියේ කෙටිමං බොහෝ විට මතු වන ස්ථානයයි. නොවෙනස්ව පවතින ස්කන්ධය පමණක් තහවුරු කරන වෙළෙන්දෙකුට එකම නාමික ස්කන්ධයක් සහිත මකාදැමීමේ සමාවයවිකයක් මග හැරිය හැක., හෝ වැරදි අවශේෂ මත ස්ථාපනය කරන ලද ෆොස්ෆෝ-අඩවිය. අනුක්‍රමික මට්ටමේ විශ්වාසය සඳහා පෙප්ටයිඩ සිතියම්කරණය හෝ MS/MS ඛණ්ඩනය අවශ්‍ය වේ, සංයුතිය සඳහා ඇමයිනෝ අම්ල විශ්ලේෂණය, සහ - දැඩි ලෙස වෙනස් කරන ලද ඉදිකිරීම් සඳහා - එක් එක් ස්ථාපිත කණ්ඩායම අපේක්ෂිත ස්ථානයේ වාඩි වී සිටින බව තහවුරු කිරීම. අසාර්ථක පිරිහෙන තිරයක් හෝ ප්‍රහේලිකාවක් වන DUB ප්‍රතිඵලයක් “එක් අවශේෂයක් මගින් උපස්ථර අනුක්‍රමය වැරදියි,” පිරිවැය යනු කිසිදු පහළ ප්‍රවාහ මෘදුකාංගයකට නිවැරදි කළ නොහැකි සති ගණන් ප්‍රතිනිෂ්පාදනය කළ නොහැකි දත්ත වේ.

විකලාංග විශ්ලේෂණ තහවුරු කිරීම විශ්වාසය වැඩි කරයි

තනි විශ්ලේෂණාත්මක සංඥාවක් කලාතුරකින් අනන්‍යතාවය නිරවුල් කරයි. යුරෝපීය ඖෂධ ඒජන්සියේ මාර්ගෝපදේශය සංවර්ධනය සින්තටික් පෙප්ටයිඩ සහ සින්තටික් පෙප්ටයිඩ නිෂ්පාදනය හඳුනා ගැනීම සඳහා අවම වශයෙන් විකලාංග ක්‍රම දෙකක් නිර්දේශ කරයි, සහ විකලාංග ප්‍රමාණය -, අයකිරීම-, සහ සංශුද්ධතාවය ගුනාංගීකරනය සඳහා ජලභීතිකාව මත පදනම් වූ ප්‍රවේශයන්.

සරල රේඛීය පෙප්ටයිඩ වලට වඩා ලේබල් කරන ලද සහ වෙනස් කරන ලද ප්‍රතික්‍රියාකාරක සඳහා විකලාංග තහවුරු කිරීම වැදගත් වේ., මක්නිසාද යත් එක් වර්ණදේහ ක්‍රමයක් සෑම අපිරිසිදු පවුලක්ම විසඳන්නේ නැත. සංකීර්ණ පිරික්සුම් නිර්මාණයක් පරීක්ෂා කරන රසායනඥයෙක් සාමාන්‍යයෙන් ප්‍රතිලෝම-අදියර HPLC දෙවන තීරු රසායන විද්‍යාව සමඟ යුගල කරයි., MS/MS හෝ පෙප්ටයිඩ සිතියම්කරණය සමඟ ස්කන්ධ තහවුරු කිරීම ඒකාබද්ධ කරන්න, සහ ඒකරාශී කිරීමේ තත්ත්වය සඳහා බහු-කෝණ ආලෝක විසිරීම සමඟ ස්ටීරියෝකෙමිකල් අඛණ්ඩතාව හෝ ප්‍රමාණයෙන් බැහැර කිරීම සඳහා චිරල් වෙන් කිරීම වැනි ඉලක්කගත ක්‍රම එක් කරන්න.. ප්රතික්රියාකාරකය ප්රමාණාත්මක කියවීමක් පෝෂණය කරන විට, මෙම ස්ථර සාක්ෂිය ඔබට අනන්‍යතාවය සහ සංශුද්ධතා හිමිකම් සැබෑ සහ ප්‍රතිනිෂ්පාදනය කළ හැකි බව විශ්වාස කිරීමට ඉඩ සලසයි - එක් උච්ච ප්‍රදේශයක ප්‍රතිශතයක් නොවේ.

Screening Libraries Batch Consistency මත ජීවත් වීම හෝ මිය යාම

බොහෝ ළිං වලින් තිර පුස්තකාල ඉදිකර ඇත, බොහෝ කුප්පි, සහ - ඔබ කලින් සැලසුම් නොකළහොත් - බොහෝ නිෂ්පාදන කොටස්. කල්පවත්නා තිරවල නිස්කලංක ඝාතකයා වන්නේ කණ්ඩායමෙන් කණ්ඩායමට විචල්‍යතාවයයි, මක්නිසාද යත් සෑම කණ්ඩායමක්ම නාමිකව එහි සංශුද්ධතා පිරිවිතර පසු කරන විට පවා සුළු අපිරිසිදුකමක ප්ලාවනය වීම හෝ වෙනස් වූ වර්ණදේහ ඇඟිලි සලකුණක් විශ්ලේෂණ හැසිරීම වෙනස් කරයි.

අනුකූලතා විනය සංරචක තුනක් ඇත:

• ගොඩක් සොයා ගැනීමේ හැකියාව - එක් එක් කුප්පිය හෝ පුස්තකාල තහඩුව නිශ්චිත කණ්ඩායම් හඳුනාගැනීමක් සහ කණ්ඩායමට විශේෂිත විශ්ලේෂණ සහතිකයක් සමඟ සම්බන්ධ වේ, එබැවින් ඕනෑම ප්‍රතිඵලයක් එය නිෂ්පාදනය කළ ද්‍රව්‍ය මත සොයා ගත හැක.

• ඇඟිලි සලකුණු සංසන්දනය - නව කැබලි අක්ෂර රඳවා තබා ගැනීමේ කාලය අනුව පෙර කැබලි අක්ෂර හා විමර්ශන ප්‍රමිතීන්ට සාපේක්ෂව සංසන්දනය කෙරේ, ස්කන්ධය, සහ අපිරිසිදු පැතිකඩ, සමත්/අසමත් සංශුද්ධතා අංකයකින් පමණක් නොවේ.

• ලේඛනගත අමු දත්ත - වෛෂයික සාක්ෂි (chromatograms, ස්කන්ධ වර්ණාවලි) සාරාංශ ප්‍රතිශතයකට වඩා එක් එක් කණ්ඩායම සමඟ සපයා ඇත, එබැවින් පරීක්ෂණ රසායනාගාරවලට තමන්ටම අනුකූලතාව විනිශ්චය කළ හැකිය. පෙප්ටයිඩ නිෂ්පාදනය

විශාල පිරිහීමක් හෝ පරීක්ෂණ පුස්තකාලයක් සඳහා වන ප්‍රායෝගික රීතිය වන්නේ කණ්ඩායම් ඇඟිලි සලකුණු සාමාන්‍ය දෙයක් ලෙස සලකන හවුල්කරුවෙකුගෙන් මූලාශ්‍රය ලබා ගැනීම සහ ලබා දී ඇති කොටස ඔබේ පෙර පහරවල් වලංගු කළ එකට සැසඳෙන ආකාරය නිරූපණය කළ හැකිය..

ප්‍රෝටීන්-ඩීග්‍රේඩේෂන් ස්ක්‍රීන් ශ්‍රේණිය: ඔබ මූලාශ්‍ර කරන විට "ප්‍රමාණවත් තරම්" පෙනෙන්නේ කෙසේද?

ඔබ ප්‍රතික්‍රියාකාරකයක් පිරික්සන විට හෝ සැපයුම්කරුවෙකු ඇගයීමට ලක් කරන විට ඔබට මේ සියල්ල කෙටි අපේක්ෂා සමූහයකට පරිවර්තනය කළ හැක.. ප්රායෝගිකව, පිරිහීමේ කාර්ය ප්‍රවාහයන් ක්‍රියාත්මක කරන රසායනාගාර ලබා දී ඇති QC ගැන සාකච්ඡා කරන හවුල්කරුවන් සොයයි අභිරුචි පෙප්ටයිඩ සංස්ලේෂණය තනි සංශුද්ධතා රූපයක් භාර දීමට වඩා ඇණවුම් කරන්න.

අත්‍යාවශ්‍ය දේ වේ: අනන්‍යතාවය නොවෙනස්ව පවතින ස්කන්ධයට වඩා වැඩි ගණනකින් තහවුරු වේ; ලේබලය සහ එක් එක් වෙනස් කිරීම් අවසාන සංයෝජන මත සත්‍යාපනය කර ඇත; අවශ්‍ය අවස්ථාවලදී ඇමයිනෝ අම්ල හෝ සිතියම්කරණ මට්ටමේ විශ්ලේෂණයක් සමඟින් ලේඛනගත කර ඇති අනුක්‍රමික විශ්වාසවන්තභාවය; සංශුද්ධතාවය සහ ගුනාංගීකරන හිමිකම් පිටුපස ඇති විකලාංග විශ්ලේෂණ ක්‍රම; a පෙප්ටයිඩ පරීක්ෂාව එක් කොටසකට අමු වර්ණාවලි සහ ස්කන්ධ වර්ණාවලි ඇතුළත් වාර්තාව; සහ කාණ්ඩ ඇඟිලි සලකුණු අනුකූලතාව පුස්තකාලය පුරා පවත්වාගෙන යයි.

පිළිගත් සංස්ලේෂණ වේදිකාවක් ග්‍රහණ ශ්‍රේණියේ විකලාංග වෙන්වීමක් ගෙන එනු ඇත, MS/MS මට්ටමේ තහවුරු කිරීම, endotoxin සහ bioburden සීමාවන්, සහ මේසයට ගොඩක් මට්ටමේ ලියකියවිලි - පිරිසිදු තිරයක් නිපදවන ප්‍රතික්‍රියාකාරකයක් සහ ළිං සියයක් හරහා නිහඬව ව්‍යාජ ධනාත්මක නිෂ්පාදනය කරන ප්‍රතික්‍රියාකාරකයක් අතර වෙනස එය වන බැවිනි..

ප්රධාන රැගෙන යාම: ප්රෝටීන්-හායනය පිරික්සීමේදී, ප්‍රතික්‍රියාකාරක ගුණය තක්සේරු වලංගු භාවයයි. මාපිය අනුපිළිවෙලට වඩා ලේබල් කළ විශේෂ සත්‍යාපනය කරන්න, එක් එක් වෙනස් කිරීමේ අඩවිය තහවුරු කරන්න, විකලාංග විශ්ලේෂණ ක්රම භාවිතා කරන්න, සහ හරස් කාණ්ඩ ඇඟිලි සලකුණු අනුකූලතාව බලාත්මක කරන්න - මක්නිසාද යත් කියවීමෙන් මේවායින් කුමක් මඟ හැරුණත් නිහඬව පිළිබිඹු වනු ඇත.

ඊළඟ පියවර

ඔබේ තිරය සැබවින්ම රඳා පවතින ප්‍රතික්‍රියාකාරක පන්ති ලිවීමෙන් ආරම්භ කරන්න - වාර්තාකරු, විමර්ශනය, හෝ උපස්ථරය - සහ එක් එක් කෙනාට අවශ්‍ය විශ්ලේෂණාත්මක ලියකියවිලි. ඔබ මූලාශ්‍ර කරන විට එය මූලික පදනම ලෙස භාවිතා කරන්න, සහ ඔබ ධාවනය කිරීමට යන ද්‍රව්‍ය පිටුපස විකලාංග ක්‍රම සහ බොහෝ ඇඟිලි සලකුණු සාක්ෂි හරහා ඔබව ගෙන යන ලෙස සැපයුම්කරුවන්ගෙන් ඉල්ලා සිටින්න. QC ඉදිරියෙන් සමාලෝචනය කිරීමට ගත කරන මිනිත්තු කිහිපයක් විවේක ගැනීමට සති කිහිපයක් ගත වන ප්‍රතිනිෂ්පාදනය කළ නොහැකි පරීක්ෂණ ප්‍රතිඵලයකින් ඔබව ගලවා ගත හැකිය.