Што насамрэч павінен рабіць рэагент для скрынінга дэградацыі
Перад ацэнкай КК, гэта дапамагае падзяліць задзейнічаныя класы рэагентаў. Стандартныя пратэёмныя і хімічныя датчыкі адрозніваюць флуоресцентные рэпарцёры, зонды на аснове дзейнасці, і рэагенты для ўзбагачэння сродства, кожны ператварае убиквитин-пратэасомную сістэму (КБС) актыўнасці ў вымерныя паказчыкі ў клетках, лізаты, або бясклетачныя рэакцыі.
-
Флуарэсцэнтныя этыкеткі дазваляюць візуалізаваць або колькасна вызначыць актыўныя ферменты, субадзінак протеасомы, або рэпарцёрныя субстраты з дапамогай флуарэсцэнцыі ў гелі, мікраскапія, або рэпарцёры ўзмацнення/страты сігналу.
-
Біятынавыя этыкеткі з'яўляюцца інструментамі ўзбагачэння, захоп актыўных деубиквитиназ (ДУБЫ) або мадыфікаваныя вавёркі шляхам выцягвання стрэптавідыну перад імунаблотінгам або мас-спектраметрычнай ідэнтыфікацыяй.
-
Убиквитин і NEDD8-міметычныя зонды і флюарагенныя або FRET субстраты апытваюць ферменты і лігазы, якія павінны адрозніваць убіквіцін ад убіквіцін-падобных мадыфікатараў - хіміі, якая вырашае, ці сапраўды адбылася мэтанакіраваная дэградацыя.
-
Дэградацыя падкладак нясуць дэстабілізуючую або дэгронавую паслядоўнасць, так што страта, кіраваная злучэннем або залежная ад пратэасомы, выклікае змяненне сігналу, якое паддаецца колькаснай ацэнцы.
Кожная з гэтых роляў залежыць ад драбнюткіх структурных дэталяў: які астатак пазначаны, дзе знаходзіцца мадыфікацыя, ці правільная ізапептыдная або аксіэфірная сувязь, і ці прысутнічае боегалоўка на правільным канцы. Рэагент, «95% чысціня» якога хавае дамінуючы дэзамідаваны або дэлецыйны ізамер, можа змяніць звязванне, стабільнасць, або відавочная хуткасць пагаршэння, дастатковая для змены інтэрпрэтацыі ўсяго экрана.
Пазначаныя пептыды патрабуюць пацверджання на цэтліку
Флуарэсцэнтная або біятынавая бірка не з'яўляецца пасіўным дадаткам. Кан'югацыя змяняе як час утрымання, так і іянізацыю ў храматаграфіі, і гэта ўводзіць прадказальны масавы зрух - але толькі калі меркаваны від - гэта тое, што ўтварылася.
Якасць рэагентаў тут азначае пацвярджэнне пазначаны віды, не толькі бацькоўскі пептыда. Гэта звычайна патрабуе:
-
Сінтэз пептыдаў маса-спектраметрычная праверка дададзенай этыкеткі праз чаканы зрух масы;
-
Праверкі LC-MS або UPLC, каб пацвердзіць, што пазначаная малекула элюіруецца і іянізуецца, як вызначана, дамінуючы выгляд;
-
асобная ідэнтыфікацыйная справаздача для этыкеткі, таму што яго змененыя паводзіны могуць маскіраваць пабочныя прадукты, якія вылучаюцца разам.
Для біятыну, праблема ўзбагачэння вернасці: часткова пазначаная або няправільна біятыніляваная партыя можа па-іншаму звязваць стрэптавідын і збіваць няправільны набор бялкоў. Для флюарафораў, рэжым адмовы іншы, але аднолькава разбуральны - прымешка, якая аўтафлюарэсцэнцыі на даўжыні хвалі аналізу імітуе сапраўдны сігнал і завышае ўзровень трапленняў. Скрынінгавыя лабараторыі ўсё часцей просяць прадаўцоў паведамляць дакладную пазначаную масу і храматаграму канчатковага кан'югата, не толькі чысціня паслядоўнасці.
Мадыфікацыі, характэрныя для аналізу, павінны быць правераны, Не мяркуецца
Рэагенты дэградацыі часта не з'яўляюцца простымі пептыдамі. Яны нясуць убіквіцін-міметычныя або NEDD8-міметычныя элементы, электрафільныя боегалоўкі, сродства ручкі, лінкеры, і FRET або флюарагенныя пары. Цяжар доказу заключаецца ў пацверджанні таго, што прызначаны структура дамінуе ў лоце і што няма ненаўмыснага ізамера, усечэнне, або пабочны прадукт назапасіўся да ўзроўню, які парушае аналіз.
Для маломалекулярных дэградатараў, аналітычная практыка ўжо відавочная: надзейная ўпакоўка выкарыстоўвае LC-MS або HPLC для арганічнай чысціні, ЯМР або qNMR для структуры і балансу масы, і часта хіральны або металічны аналіз, каб выявіць стэрэацэнтрычную эпімерызацыю і сляды металічных забруджванняў, якія могуць пагасіць каардынацыю цынку. Пептыдныя і бялковыя рэагенты, якія сілкуюць адны і тыя ж экраны, заслугоўваюць такой жа дысцыпліны — праверка месца мадыфікацыі, пацвярджэнне сувязі і канцавых вузлоў, і яснасць таго, ці можа дамінуючая прымешка перашкаджаць біялагічнаму счытванню.
Дакладнасць паслядоўнасці не падлягае абмеркаванню
Скрынінгавыя бібліятэкі і наборы зондаў звычайна ўпарадкоўваюцца ў адпаведнасці з вызначанай першаснай структурай, якая кадуе дэгрон, матыў прызнання, месца зрэзу фермента, або сігнал, які залежыць ад фасфаралявання. Дакладнасць паслядоўнасці азначае, што структура - гэта тое, што фактычна адпраўлена - без выдалення, без замены, няма няправільнай рэгістрацыі, і правільна Н- і С-канцы.
Вернасць - гэта тое, дзе часцей за ўсё ўсплываюць ярлыкі даследчага ўзроўню. Пастаўшчык, які пацвярджае толькі непашкоджаную масу, можа прапусціць дэлецыйны ізамер з такой жа намінальнай масай, або фасфа-сайт, усталяваны на няправільным астатку. Упэўненасць на ўзроўні паслядоўнасці патрабуе карціравання пептыдаў або фрагментацыі MS/MS, аналіз амінакіслот на склад, і — для моцна мадыфікаваных канструкцый — пацверджанне таго, што кожная ўсталяваная група знаходзіцца на прызначаным месцы. Калі няўдалы экран дэградатара або незразумелы вынік DUB узыходзіць да таго, што «паслядоўнасць субстрата была няправільнай на адзін астатак,»кошт - гэта некалькі тыдняў неўзнаўляльных даных, якія ніякае далейшае праграмнае забеспячэнне не можа выправіць.
Артаганальнае аналітычнае пацверджанне павышае давер
Адзіны аналітычны сігнал рэдка вызначае ідэнтычнасць. Кіраўніцтва Еўрапейскага агенцтва па леках развіццё Сінтэтычныя пептыды і вытворчасць сінтэтычных пептыдаў рэкамендуе па меншай меры два артаганальных метаду ідэнтыфікацыі, і артаганальны памер-, зарад-, і падыходы на аснове гідрафобнасці для характарыстыкі чысціні.
Артаганальнае пацверджанне мае большае значэнне для пазначаных і мадыфікаваных рэагентаў, чым для простых лінейных пептыдаў, таму што ні адзін храматаграфічны метад не дазваляе ліквідаваць кожнае сямейства прымешак. Хімік, які правярае складаную скрынінгавую канструкцыю, звычайна злучае ВЭЖХ з зваротнай фазай і хімію другой калонкі, аб'яднаць масавае пацверджанне з MS/MS або пептыдным карціраваннем, і дадаць мэтанакіраваныя метады, такія як хіральны падзел для стэрэахімічнай цэласнасці або выключэнне памеру з рознавугольным рассейваннем святла для агрэгацыйнага стану. Калі рэагент падае колькаснае счытванне, гэта шматслаёвае сведчанне - гэта тое, што дазваляе вам верыць у тое, што прэтэнзіі на ідэнтычнасць і чысціню рэальныя і ўзнаўляльныя - ні аднаго працэнта плошчы піку.
Скрынінг бібліятэк, якія жывуць або паміраюць ад кансістэнцыі пакетаў
Скрынінгавыя бібліятэкі будуюцца з мноства калодзежаў, шмат флаконаў, і - калі вы не плануеце загадзя - шмат партый вытворчасці. Зменлівасць ад партыі да партыі - ціхі забойца падоўжных экранаў, таму што дрэйф нязначнай прымешкі або зрушэнне храматаграфічнага адбітка пальцаў змяняе паводзіны аналізу, нават калі кожная партыя намінальна праходзіць свае характарыстыкі чысціні.
Дысцыпліна паслядоўнасці складаецца з трох кампанентаў:
-
Адсочванне партыі — кожны флакон або бібліятэчная пласціна звязаны з дакладным ідэнтыфікатарам партыі і сертыфікатам аналізу канкрэтнай партыі, таму любы вынік можна прасачыць да матэрыялу, які яго вырабіў.
-
Параўнанне адбіткаў пальцаў — новыя партыі параўноўваюцца з папярэднімі партыямі і эталоннымі стандартамі па часе захоўвання, маса, і профіль прымешак, не толькі па ліку чысціні "прайшло/не прайшло"..
-
Задакументаваныя зыходныя дадзеныя — аб'ектыўныя доказы (храматаграмы, мас-спектры) прадастаўляецца з кожнай партыяй, а не зводны працэнт, так што скрынінгавыя лабараторыі могуць самі судзіць аб кансістэнцыі. Вытворчасць пептыдаў
Практычным правілам для вялікай бібліятэкі дэградатараў або зондаў з'яўляецца атрыманне крыніц ад партнёра, які разглядае пакетную дактыласкапію як руціну і можа прадэманстраваць, як дадзеная партыя параўноўваецца з той, якая пацвердзіла вашы папярэднія трапленні.
Ацэнка скрынінга дэградацыі бялку: Як выглядае "дастаткова добра", калі вы шукаеце крыніцу
Вы можаце перавесці ўсё гэта ў кароткі набор чаканняў, калі вызначаеце рэагент або ацэньваеце пастаўшчыка. На практыцы, лабараторыі, якія запускаюць працоўныя працэсы дэградацыі, шукаюць партнёраў, якія будуць абмяркоўваць КК за дадзеным сінтэз пептыдаў на заказ заказ, а не перадаць адну фігуру чысціні.
Самае неабходнае ёсць: ідэнтычнасць пацверджана больш чым непашкоджанай масай; этыкетка і кожная мадыфікацыя правяраюцца на канчатковым кан'югаце; дакладнасць паслядоўнасці дакументавана з дапамогай аналізу амінакіслот або адлюстравання на ўзроўні, дзе гэта неабходна; артаганальныя аналітычныя метады, якія стаяць за прэтэнзіямі на чысціню і характарыстыку; а пептыдная тэставанне запіс, які ўключае неапрацаваныя храматаграмы і мас-спектры на партыю; і паслядоўнасць пакетных адбіткаў пальцаў падтрымліваецца па ўсёй бібліятэцы.
Аўтарытэтная платформа сінтэзу прынясе артаганальнае раздзяленне ўзроўню захопу, Пацвярджэнне ўзроўню MS/MS, межы эндатаксінаў і біянагрузкі, і дакументацыю на ўзроўні партыі ў стол - таму што гэта розніца паміж рэагентам, які стварае чысты экран, і рэагентам, які спакойна вырабляе ілжывыя спрацоўванні ў ста лунках.
Ключ на вынас: Пры скрынінгу дэградацыі бялку, якасць рэагентаў - гэта сапраўднасць аналізу. Праверце маркіраваныя віды па бацькоўскай паслядоўнасці, пацвярджаць кожны сайт мадыфікацыі, выкарыстоўваць метады артаганальнага аналізу, і забяспечвайце ўзгодненасць адбіткаў пальцаў паміж партыямі - таму што счытванне будзе моўчкі адлюстроўваць любы з іх, які быў прапушчаны.
Наступныя крокі
Пачніце з запісу класаў рэагентаў, ад якіх залежыць ваш экран - рэпарцёр, зонд, або субстрат — і аналітычную дакументацыю, неабходную кожнаму. Выкарыстоўвайце гэта ў якасці базавага ўзроўню, калі вы будзеце атрымліваць крыніцы, і папрасіце пастаўшчыкоў правесці вас праз артаганальныя метады і доказы адбіткаў пальцаў ад партыі да партыі, якія ляжаць у аснове матэрыялу, які вы збіраецеся запусціць. Некалькі хвілін, выдаткаваных на папярэдні агляд кантролю якасці, могуць пазбавіць вас ад неўзнаўляльнага выніку скрынінга, які патрабуе тыдняў, каб расслабіцца.
