Eine geeignete Auflösungsmethode ist ein wichtiger Faktor für den Erfolg von Peptidexperimenten. Eine unsachgemäße Auflösung führt zum Verlust von Peptiden und zum Scheitern des Experiments. Die Suche nach der idealen Auflösungsmethode ist jedoch manchmal recht schwierig. Im Folgenden sind die von den beiden technischen Gruppen von MOL Changes vorgeschlagenen Auflösungsmethoden aufgeführt.
MOL ändert Leitfaden zur Auflösung der Technologiegruppe
Das Hauptproblem bei der Peptidauflösung ist die Bildung der Sekundärstruktur.
Obwohl die Bildung von Sekundärstrukturen bei hydrophoben Peptidketten offensichtlicher ist, tritt dieses Phänomen, abgesehen von den kürzesten Peptidketten, bei fast allen Peptidketten auf, unabhängig von der Polarität. Daher ist der erste Grundsatz beim Lösen von Polypeptiden die Verwendung von sterilem destilliertem Wasser oder deionisiertem Wasser (oder sauerstofffreiem Wasser, wenn die Bedingungen es erlauben).
Die Peptidlösung kann bakteriell zersetzt werden. Um dieses Phänomen zu vermeiden, sollte das Peptid in sterilem, destilliertem Wasser gelöst oder zur Sterilisation mit einer Filtermembran mit einer Porengröße von 0,45 oder 0,2 μm gefiltert werden. Polypeptide, die Cys, Met und Trp enthalten, sind besonders oxidationsempfindlich und sollten daher in sauerstofffreiem Wasser gelöst werden. Sauerstofffreies Wasser kann durch Entgasen unter vermindertem Druck durch Einleiten von Inertgasen (Stickstoff, Helium und Argon) gewonnen werden.
Wenn das Peptid in reinem Wasser unlöslich ist, kann eine Ultraschallbehandlung dazu beitragen, die Partikel aufzubrechen und die Löslichkeit zu erhöhen. Hinweis: Die Ultraschallbehandlung führt zur Erwärmung der Lösung und zum Abbau des Peptids.
Enthält das Peptid mehrere basische Aminosäuren, verwenden Sie 1~10% wässrige Essigsäurelösung; für sehr hydrophobe Peptide verwenden Sie 50% Essigsäure.
Enthält das Polypeptid eine große Menge an sauren Aminosäuren, kann es in einer 1 bis 10% Ammoniaklösung oder einem flüchtigen alkalischen Puffer wie Ethylmorphinacetat oder Bicarbonat gelöst werden. Der pH-Wert muss vor der Chromatographie eingestellt werden.
Wenn das Peptid auf die Säule geladen werden soll, muss die Menge des organischen Lösungsmittels sehr gering sein, da sonst die Retentionszeit stark beeinträchtigt wird.
Wenn das Polypeptid stark hydrophob ist, weil es aromatische Kohlenwasserstoff-Seitenketten wie Val, Leu, Met, Phe, Tyr, Ala usw. enthält, oder wenn es sich um ein neutrales Peptid handelt, kann die Verwendung von Membran-Denaturierungsmitteln wie DMF oder DMSO zur Auflösung des Polypeptids beitragen:
a. Hochkonzentrierte Membran-Denaturierungsmittel tragen dazu bei, das Polypeptid aufzulösen, indem sie seine Sekundärstruktur zerstören.
b. Denaturierungsmittel für Membranen eignen sich für die Herstellung von Peptidanalyselösungen, können aber die Erforschung ihrer biologischen Aktivität beeinträchtigen.
c. DMF ist das beste Denaturierungsmittel (die höchste Konzentration kann 30% erreichen) und wird tropfenweise zugegeben, bis das Peptid aufgelöst ist.
d. Bei der Umkehrphasenchromatographie fließt das DMF zusammen mit dem vorderen Peak des Eluenten aus. Je nach Injektionsvolumen kann der Peakwert sehr hoch sein. Die meisten Peptide können innerhalb weniger Minuten eluieren, nachdem eine große Menge DMF eluiert wurde. Wenn die Peptidkette klein ist und zu früh eluiert, wird die Peptidmenge reduziert.
MOL ändert Leitfaden zur Auflösung der technischen Gruppe II
Unterscheidung, ob Aminosäuren neutral, sauer oder alkalisch sind, und Berechnung der Auflösungsmethode:
1. Weisen Sie jeder sauren Aminosäure in der Polypeptidsequenz, einschließlich der Asparaginsäure Asp (D), der Glutaminsäure Glu (E) und der C-terminalen Carboxyl-COOH, den Wert -1 zu; jeder basischen Aminosäure, einschließlich Arginin Arg (R), Lysin Lys (K), Histidin His (H) und der N-terminalen Amino-NH2, wird ein Wert von +1 zugewiesen; neutrale Aminosäuren sind 0. Auf dieser Grundlage wird der Wert des gesamten Polypeptids berechnet, und der Wert ist positiv. Peptide mit einem negativen Wert werden als basische Peptide bezeichnet, solche mit einem negativen Wert als saure Peptide, und solche mit einem Wert von Null werden als neutrale Peptide bezeichnet.
2. Wenn es sich um ein alkalisches Peptid handelt, versuchen Sie es zunächst mit Wasser aufzulösen; wenn es sich nicht auflösen lässt, versuchen Sie, 10% - 30% Essigsäure zu verwenden; wenn das Peptid immer noch unlöslich ist, versuchen Sie, reine Essigsäure und Trifluoressigsäure TFA (<50 μl) zu verwenden, um es aufzulösen, und verdünnen Sie dann die Peptidlösung auf die gewünschte Konzentration.
3. Wenn es sich um ein saures Peptid handelt, versuchen Sie es zunächst in Wasser aufzulösen; wenn es sich nicht in Wasser auflösen lässt, versuchen Sie es mit 13% Ammoniakwasser (v/v) aufzulösen, und verdünnen Sie die Peptidlösung auf die gewünschte Konzentration. Wenn die Peptidsequenz Cystein Cys (C) enthält, kann sie nicht in alkalischer Lösung aufgelöst werden. Versuchen Sie bitte die folgenden Methoden.
4. Neutrale Peptide werden in der Regel in organischen Lösungsmitteln aufgelöst. Versuchen Sie zunächst, Acetonitril (Acetonitril), Methanol (Methanol) oder Isopropanol (Isopropanol) zum Lösen zu verwenden; bei sehr hydrophoben Peptiden lösen Sie zunächst mit einer kleinen Menge Dimethylsulfoxid (DMSO) und verdünnen Sie mit Wasser auf die erforderliche Konzentration; wenn die Peptidsequenz Cystein Cys (C) enthält, verwenden Sie Dimethylformamid (DMF) oder N-Methylpyrrolidon (NMP) zum Lösen. Bei Peptiden, die zur Aggregation neigen, fügen Sie zunächst 6M Guanidin-HCl oder 8M Harnstoff (Urea) hinzu, um sie aufzulösen, und verdünnen Sie sie dann auf die erforderliche Konzentration.
veranschaulichen:
1. Um die Lagerung und spätere Verwendung zu erleichtern, wird empfohlen, das Peptid auf eine Konzentration von etwa 1-2 mg/ml aufzulösen.
2. Gewöhnliches gefriergetrocknetes Peptidpulver kann bei -20°C mehr als ein Jahr lang gelagert werden. Bei gelösten Peptiden wird empfohlen, sie zu aliquotieren und bei -20°C zu lagern. Enthält die Peptidsequenz Methionin Met (M), Cysteinsäure Cys (C) oder Tyrosin Tyr (Y), wird empfohlen, sie in einer sauerstofffreien Umgebung zu lagern, um Oxidation zu vermeiden.
Beigefügte Aminosäurenliste:
1.neutrale Aminosäuren: Glycin, Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Cystein, Methionin, Threonin, Serin, Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophansäure, Prolin, Asparagin und Glutamin
FEigenschaften: Diese Art von Aminosäuremolekül enthält nur eine Aminogruppe und eine Carboxylgruppe
2. saure Aminosäuren: Glutaminsäure, Asparaginsäure
Merkmale: Diese Art von Aminosäuremolekül enthält eine Aminogruppe und zwei Carboxylgruppen
3. basische Aminosäuren: Lysin, Arginin, Histidin
Merkmale: Diese Art von Aminosäure enthält eine Diaminocarboxylgruppe in ihrem Molekül; Histidin hat einen Stickstoffring und ist schwach alkalisch und gehört ebenfalls zu den basischen Aminosäuren.
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