Un metodo di dissoluzione appropriato è un fattore importante per il successo degli esperimenti sui peptidi. Una dissoluzione non corretta causa la perdita di peptidi e il fallimento dell'esperimento. Tuttavia, trovare il metodo di dissoluzione ideale è talvolta piuttosto impegnativo. Di seguito sono riportati i metodi di dissoluzione proposti dai due gruppi tecnici di MOL Changes. metodo
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Il problema principale della dissoluzione dei peptidi è la formazione della struttura secondaria.
Sebbene la formazione di strutture secondarie delle catene peptidiche idrofobiche sia più evidente, ad eccezione delle catene peptidiche più corte, questo fenomeno si verifica in quasi tutte le catene peptidiche, indipendentemente dalla polarità. Pertanto, il primo principio di dissoluzione dei polipeptidi è quello di utilizzare acqua distillata sterile o acqua deionizzata (o acqua priva di ossigeno se le condizioni lo consentono).
La soluzione di peptide può andare incontro a degradazione batterica. Per evitare questo fenomeno, il peptide deve essere disciolto in acqua distillata sterile o filtrato con una membrana filtrante con una dimensione dei pori di 0,45 o 0,2 μm per la sterilizzazione. I polipeptidi contenenti Cys, Met e Trp sono particolarmente suscettibili all'ossidazione, pertanto devono essere disciolti in acqua priva di ossigeno. L'acqua priva di ossigeno può essere ottenuta mediante degassificazione a pressione ridotta con l'iniezione di gas inerti (azoto, elio e argon).
Se il peptide è insolubile in acqua pura, il trattamento a ultrasuoni può contribuire a rompere le particelle e ad aumentare la solubilità. Nota: il trattamento a ultrasuoni provoca il riscaldamento della soluzione e la degradazione del peptide.
Se il peptide contiene più aminoacidi basici, utilizzare una soluzione acquosa di acido acetico 1~10%; per peptidi molto idrofobici, utilizzare acido acetico 50%.
Se il polipeptide contiene una grande quantità di amminoacidi acidi, può essere disciolto in una soluzione di ammoniaca da 1 a 10% o in un tampone alcalino volatile come l'acetato di etil morfina o il bicarbonato. Il valore del pH deve essere regolato prima della cromatografia.
Se il peptide deve essere caricato sulla colonna, la quantità di solvente organico deve essere molto ridotta, altrimenti il tempo di ritenzione sarà seriamente compromesso.
Se il polipeptide è altamente idrofobico perché contiene catene laterali di idrocarburi aromatici come Val, Leu, Met, Phe, Tyr, Ala, ecc. o è un peptide neutro, l'uso di denaturanti di membrana come DMF o DMSO può aiutare a sciogliere il polipeptide:
a. I denaturanti di membrana ad alta concentrazione aiutano a dissolvere il polipeptide distruggendone la struttura secondaria.
b. I denaturanti di membrana sono adatti alla preparazione di soluzioni per l'analisi dei peptidi, ma possono interferire con la ricerca sulla loro attività biologica.
c. Il DMF è il miglior denaturante (la concentrazione più alta può raggiungere 30%) e viene aggiunto a goccia a goccia fino a quando il peptide non è dissolto.
d. Durante la cromatografia a fase inversa, il DMF fuoriesce insieme al picco anteriore dell'eluente. A seconda del volume di iniezione, il valore del picco può essere molto elevato. La maggior parte dei peptidi può eluire in pochi minuti dopo l'eluizione di una grande quantità di DMF. Se la catena peptidica è piccola ed eluisce troppo presto, la quantità di peptide sarà ridotta.
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Come distinguere se gli amminoacidi sono neutri, acidi o alcalini e calcolare il metodo di dissoluzione:
Assegnare a ciascun amminoacido acido della sequenza polipeptidica, tra cui l'acido aspartico Asp (D), l'acido glutammico Glu (E) e il carbossile-COOH C-terminale, il valore -1; a ciascun amminoacido basico, tra cui l'arginina Arg ( R), la lisina Lys (K), l'istidina His (H) e l'ammino-NH2 N-terminale, il valore +1; agli amminoacidi neutri il valore 0. Su questa base, viene calcolato il valore dell'intero polipeptide e il punteggio è positivo I peptidi con un punteggio negativo sono chiamati peptidi basici, quelli con un punteggio negativo sono chiamati peptidi acidi e quelli con un punteggio pari a zero sono chiamati peptidi neutri.
2. Se si tratta di un peptide alcalino, provare prima a scioglierlo con acqua; se non può essere sciolto, provare a usare acido acetico 10% - 30%; se il peptide è ancora insolubile, provare a usare acido acetico puro e acido trifluoroacetico TFA (<50 μl) per scioglierlo, quindi diluire la soluzione di peptide alla concentrazione desiderata.
3. Se si tratta di un peptide acido, provare a scioglierlo prima con l'acqua; se non può essere sciolto con l'acqua, provare a usare l'ammoniaca 13% (v/v) per scioglierlo e diluire la soluzione del peptide alla concentrazione richiesta. Se la sequenza peptidica contiene cisteina Cys (C), non può essere sciolta in soluzione alcalina. Provare i metodi indicati di seguito.
4. I peptidi neutri vengono solitamente disciolti in solventi organici. Per prima cosa, cercare di usare acetonitrile (acetonitrile), metanolo (metanolo) o isopropanolo (isopropanolo); per i peptidi molto idrofobici, sciogliere prima con una piccola quantità di dimetilsolfossido (DMSO) e diluire con acqua alla concentrazione richiesta; se la sequenza peptidica contiene cisteina Cys (C), usare dimetilformammide (DMF) o N-metilpirrolidone (NMP) per la dissoluzione. Per i peptidi inclini all'aggregazione, aggiungere prima 6M di guanidina-HCl o 8M di urea (Urea) per dissolverli, quindi diluirli alla concentrazione richiesta.
illustrare:
1. Per facilitare la conservazione e l'uso successivo, si raccomanda di sciogliere il peptide a una concentrazione di circa 1-2 mg/ml.
2. La normale polvere liofilizzata di peptidi può essere conservata a -20°C per più di un anno. Per i peptidi disciolti, si raccomanda di aliquotarli e conservarli a -20°C; se la sequenza peptidica contiene metionina Met (M), cisteina Acido Cys (C) o tirosina Tyr (Y) si raccomanda di conservarli in un ambiente privo di ossigeno per evitare l'ossidazione.
Elenco degli aminoacidi allegato:
1. Amminoacidi neutri: glicina, alanina, leucina, isoleucina, valina, cisteina, metionina, treonina, serina, fenilalanina, tirosina, triptofano acido, prolina, asparagina e glutammina.
Fcaratteristiche: Questo tipo di molecola di amminoacido contiene solo un gruppo amminico e un gruppo carbossilico.
2.Amminoacidi acidi: acido glutammico, acido aspartico
Caratteristiche: Questo tipo di molecola di amminoacido contiene un gruppo amminico e due gruppi carbossilici.
3.Amminoacidi di base: lisina, arginina, istidina
Caratteristiche: Questo tipo di amminoacido contiene un gruppo diaminocarbossilico nella sua molecola; l'istidina ha un anello di azoto ed è debolmente alcalina, oltre a essere un amminoacido basico.
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