Pregled
Timozin beta 4 (TV4) je beljakovina z majhno molekulo, sestavljena iz več aminokislinskih ostankov in je široko porazdeljena v različnih tkivih in celicah človeškega telesa..[1][2] Kot ena od glavnih molekul za uravnavanje aktina v človeškem telesu, ima več bioloških funkcij in igra ključno vlogo pri regeneraciji tkiv, preoblikovanje, celjenje ran, vzdrževanje aktinskega ravnovesja, razvoj tumorja in metastaze, celično apoptozo, vnetje, angiogeneza, razvoj lasnih mešičkov, in drugih fizioloških in patoloških procesov.
Biološke funkcije in mehanizmi delovanja
Tβ4 je ena od glavnih molekul za uravnavanje aktina v človeškem telesu in ima več bioloških funkcij., igra pomembno vlogo pri regeneraciji tkiv, preoblikovanje, celjenje ran, vzdrževanje aktinskega ravnovesja, razvoj tumorja in metastaze, celično apoptozo, vnetje, angiogeneza, razvoj lasnih mešičkov, in drugih fizioloških in patoloških procesov.
- Faktor, ki uravnava aktin: Actin predstavlja približno 10% celotne beljakovine v nemišičnih celicah in je bistvena sestavina, potrebna za celično strukturo, celično gibanje, in celjenje ran. Prisotnost Tβ4 v celicah zadostuje za sekvestracijo vseh aktinskih monomerov in sodelovanje pri uravnavanju polimerizacije in depolimerizacije aktina. Tβ4 se lahko veže na aktinske monomere v a 1:1 razmerje, preprečevanje tvorbe polimerov F-aktina. Vezavo Tβ4 na aktin spremlja disociacija vezane vode. C-terminal Tβ4 se veže na aktin His-40, povzročajo konformacijsko spremembo aktinskih monomerov. Molekula Tβ4 vsebuje domeno, ki veže aktin (ZAKLENJENO), ki je glavno elektrostatično kontaktno mesto. Njegov N-terminalni fragment lahko zavira polimerizacijo aktina s sterično oviranostjo. Ko deluje sam, Tβ4 lahko zavira polimerizacijo aktina in izmenjavo nukleotidov na aktinu. To je v nasprotju z vlogo drugega proteina, ki veže aktin, Profil, ki spodbuja izmenjavo ADP in ATP, pospeševanje sestavljanja aktina. [1][2]Tβ4 in Profilin lahko sinergistično regulirata sestavljanje aktina. Tβ4 lahko uravnava pretvorbo med G-aktinom in F-aktinom. Poročali so, da koncentracija Tβ4 doseže 300 pmol v zelo mobilnih krvnih celicah, medtem ko je koncentracija, ki je potrebna, da se Tβ4 veže na G-aktin, manjša od 20 pmol. S povečanjem koncentracije, Tβ4 zmanjša depolimerizacijsko sposobnost F-aktina. To je lahko razlog, zakaj Tβ4 uravnava delovanje celičnega mikrofilamentnega sistema.
Spodbujanje migracije endotelijskih celic in angiogeneze: Študije z uporabo piščančje horioalantoične membrane (CAM) modelu angiogeneze so pokazali, da ko se endotelijske celice diferencirajo v tubularne strukture, vsebnost mRNA Tβ4 se poveča za petkrat, in transfekcija s Tβ4 pospeši tvorbo cevastih struktur v klonih endotelijskih celic. Dodatno, raziskave so pokazale, da lahko Tβ4 medsebojno deluje s fibrinom in kolagenom, ki ga posreduje transglutaminaza (Faktor XIIIa) in imajo pomembno vlogo pri procesu strjevanja krvi. Nadalje, v poskusu poškodbe polne debeline kože pri starajočih se diabetičnih miših, Tβ4 lahko pospeši celjenje velikih kožnih ran in globokih opeklin, spodbujajo obnovo kože in roženice, in dokazati sposobnost pospeševanja celjenja ran.
Inhibicija celične apoptoze: Tβ4 ima pomemben zaščitni učinek na epitelijske celice roženice, ki so jih poškodovale jedke snovi, kot sta benzalkonijev klorid ali etanol.. Povečanje ekspresije gena Tβ4 je koristno za povečanje odpornosti celic na hipoksijo.[2][3]
Znižanje ključnih vnetnih molekul: Celjenje ran je kompleksen biološki proces, ki ga lahko razdelimo na tri različne stopnje: vnetje, celična proliferacija, in preoblikovanje tkiva, pri čemer se genska ekspresija ustreznih proteinov regulira navzgor in nato zniža na vsaki stopnji. Za kronične rane, ta regulativni proces lahko zmotijo dejavniki, kot je starost, osnovne bolezni, in imunosupresivna zdravila, kar vodi do prekomerne proizvodnje vnetnih molekul, prekomerno vnetje, ter zaviral celično proliferacijo in preoblikovanje tkiva. Raziskave so pokazale, da lahko Tβ4 zmanjša ravni prostih radikalov, upočasni peroksidacijo lipidov, zavirajo nastajanje vnetnih citokinov, kot je IL-1, makrofagni vnetni protein 1α (MIP1α), MIP1β, monocitni kemotaktični protein-1 (MCP-1), znižanje ravni tromboksana in prostaglandina 2α, s čimer blaži vnetje. Zato, lahko se uporablja za zdravljenje vnetnih bolezni, kot sta segmentni enteritis in atrofija mišic.
Stimulacija diferenciacije odraslih epikardialnih matičnih celic: Tβ4 ima ključno vlogo pri različnih vidikih razvoja koronarnih žil in lahko znatno spodbudi rast mirujočih epikardialnih presadkov odraslih miši, obnavljanje multipotence fibroblastov, gladke mišične celice, in endotelijskih celic, in spodbujanje njihove diferenciacije.[1][2] Izločitev gena Tβ4 v srcu vodi do pomembnega zmanjšanja ravni produkta angiogene cepitve Tβ4 (AcSDKP). Čeprav injekcija AcSDKP ne more obnoviti srca, lahko znatno poveča diferenciacijo epikardialnih matičnih celic odrasle miši v endotelne celice. To nakazuje, da sta Tβ4 in AcSDKP močna stimulatorja koronarne in neovaskularizacije, in Tβ4-inducirane epikardialne celice odrasle miši lahko služijo kot vir vaskularne regeneracije, vodi do trajne regeneracije ogrožene vaskulature na nizki ravni po poškodbi srca.
Stimulacija razvoja lasnih mešičkov: Tβ4 spodbuja migracijo, diferenciacija, in rekonstrukcijo zunajceličnega matriksa izvornih celic lasnega mešička, s čimer se uravnava rast las. Študije na podganah in miših so pokazale, da med ciklom rasti las, specifična podskupina keratinocitov lasnih mešičkov, ki izvirajo iz regije izbokline, močno sočasno izraža Tβ4, medtem ko so matične celice kože prisotne tudi v izboklini lasnega mešička. Ko je koncentracija Tβ4 na nanomolarni ravni, poveča se migracija in diferenciacija izvornih celic, in prisotnost Tβ4 prav tako poveča izražanje in izločanje matrične metaloproteinaze-2 (MMP-2), encim, ki razgrajuje zunajcelični matriks.
Povezava z nastankom tumorja: V različnih tumorskih celicah so opazili povečano regulacijo gena Tβ4, vključno z medularnim karcinomom ščitnice, rak debelega črevesa in danke, visoko maligni melanom, rak dojke, in oralni ploščatocelični karcinom. Tβ4 lahko učinkovito inducira ekspresijo rastnega faktorja vaskularnega endotelija, spodbujanje angiogeneze in aktiviranje migracijskih lastnosti celic, vodi do malignosti tumorja. Povečana regulacija ekspresije Tβ4 povzroči znižanje ekspresije E-kadherina, oslabitev celične adhezije, in povečano izražanje matričnih metaloproteinaz, zagotavljanje prednosti rasti in invazivnih lastnosti rakavim celicam, tako prispevajo k malignosti. Tβ4 ima anti-apoptotične sposobnosti, in povečana ekspresija Tβ4 lahko zmanjša obseg celične apoptoze, verjetno zaradi Tβ4, ki zavira sproščanje citokroma c in moti začetek procesa apoptoze, kar je še ena pomembna značilnost malignih tumorjev.
Spodbujanje obnove roženice: Timozin β4 je dokazal svojo sposobnost spodbujanja celjenja ran pri različnih modelih poškodb roženice in uravnavanja proizvodnje nekaterih ključnih citokinov. Raziskave so pokazale, da lahko timozin β4 zmanjša izražanje matričnih metaloproteinaz, spodbujajo preoblikovanje zunajceličnega matriksa, in aktivirajo citokine. Konkretno, zavira aktivnost matričnih metaloproteinaz, v nasprotju z zaključkom iz modelov kožnih poškodb, zdravljenih s timozinom β4. [1][2][3]To nakazuje, da se regulacijske poti specifičnih encimov v procesu obnavljanja tkiva lahko regulirajo navzgor ali navzdol.
Metoda priprave
Trenutno, obstajata dva glavna vira timozina beta 4 (TV4) uporabljajo v kliničnih in raziskovalnih okoljih: ekstrakcija iz govejega timusa in kemična sinteza. Ekstrakcija Tβ4 iz govejega timusa ni samo draga, ampak tudi omejena z razpoložljivostjo materiala in tehnikami ekstrakcije, kar ima za posledico nizko čistost in nizko vsebnost. Prisotnost nečistoč povzroča tudi številne težave, še posebej glede na naraščajoče število virusov pri govedu, kar oteži postopek ekstrakcije. Z razvojem genskega inženiringa, uporaba metod genskega inženiringa za proizvodnjo Tβ4 bo postala nova smer. V našem laboratoriju, načrtujemo izvedbo tandemske ekspresije umetno sintetiziranega Tβ4 v rastlinah, da bi pridobili transgene rastline z učinkovito ekspresijo Tβ4. V primerjavi z naravno ekstrahiranim Tβ4, Tβ4, proizveden z uporabo transgenih rastlin, ima prednosti večje bioaktivnosti, večja čistost, in manj stranskih učinkov. Dodatno, predstavlja optimalen pristop za znižanje proizvodnih stroškov, zmanjšanje kontaminacije, in omogočanje obsežne proizvodnje.[3]
Ozadje
Timozin beta 4 je peptid, sestavljen iz 43 aminokislinski ostanki z izoelektrično točko 5.1 in je zelo ohranjen pri sesalcih. Je citoplazemski protein in ne jedrski protein, za razliko od timozina alfa ali podobnih timozinov. [2][3]Timozin beta 4 sodeluje pri različnih fizioloških funkcijah, vključno z imunsko funkcijo, razvoj živčnega sistema, celjenje ran, in funkcije proteina aktina.
Za razliko od timozina alfa ali podobnih timozinov, timozin beta 4 je citoplazemski protein in ne jedrski protein. Vsebuje manj hidrofobnih aminokislin in ne vsebuje Lys-Lys-Xaa-Lys strukturne regije. Študije kemijske konformacije so pokazale, da timozin beta 4 obstaja in deluje kot ena veriga. Ima notranjo ponavljajočo se regijo med ostanki 31-43 in 18-30, s šestimi enakimi aminokislinami. Čeprav sta med ostanki dve zelo vijačni regiji 4-12 in 32-40, timozin beta 4 ne tvori prolinskega obrata. V smislu biološke porazdelitve in izražanja, timozin beta 4 je bil prvotno očiščen iz timusa. Zato, sprva so verjeli, da gre za timusni hormon, ki deluje na zgodnje zorenje T-celic. Vendar, timozin beta 4 je široko prisoten v drugih tkivih, organov, in celice, z najvišjimi ravnmi v vranici, timus, pljuča, in peritonealnih makrofagov, sledijo možgani, jetra, ledvice, moda, in srce. Tudi celice neretikuloendotelnega sistema, kot so fibroblasti, lahko sintetizirajo timozin beta 4. Timociti imajo sedemkrat višje vrednosti timozina beta 4 mRNA kot stromalne celice timusa, in timozin beta 4 izražanje opazimo v različnih tipih krvnih celic. Študije o timozinu beta 4 cDNA je pokazala, da nima signalnega peptida.[1] Čeprav so v telesu tudi izločene beljakovine, ki nimajo signalnih peptidov, kot je interlevkin-1 (IL-1) in endotelijski rastni faktorji, strokovnjaki še vedno menijo, da timozin beta 4 ni verjetno, da bi bil izločen protein in je bolj verjetno, da je bistven za nekatere osnovne celične funkcije.
Aplikacija
Osnovne in uporabne raziskave o optimizaciji delovanja endotelijskih matičnih celic s timozinom beta 4 (TV4)
Pojavnost in umrljivost zaradi ishemičnih bolezni srca in ožilja iz leta v leto naraščata, resno ogrožajo zdravje ljudi. Patogeneza teh bolezni je zelo zapletena, in disfunkcija endotelijskih celic igra ključno vlogo pri razvoju ishemičnih srčno-žilnih bolezni. Čeprav lahko zrele endotelijske celice popravijo poškodbe endotelija, njihova regeneracijska sposobnost je omejena. Endotelijske matične celice (EPC-ji) so vrsta prekurzorske celice za vaskularne endotelne celice in imajo možnost diferenciacije v endotelne celice. Številne študije so pokazale, da imajo EPC različne vloge pri obnavljanju žil in neovaskularizaciji. Vendar, klinična uporaba presaditve EPC se še vedno sooča s številnimi izzivi. Številne bolezni srca in ožilja ali dejavniki tveganja, kot je staranje, hipertenzija, hiperholesterolemija, sladkorna bolezen pa lahko zmanjša število krožečih EPC in poslabša njihovo delovanje, močno omejuje njihovo uporabo pri ishemičnih boleznih srca in ožilja. Zato, izboljšanje delovanja EPC bo pomembna strategija za prihodnjo transplantacijsko terapijo EPC.[1][2]
Timozin beta 4 (TV4), beljakovina z nizko molekulsko maso, sestavljena iz 43 aminokislinski ostanki, sodeluje pri posredovanju različnih bioloških odzivov, kot je angiogeneza, celjenje ran, in nadzor vnetja. Naše prejšnje raziskave so pokazale, da lahko Tβ4 poveča proliferacijo in migracijo EPC človeške periferne krvi, hkrati pa zavira njihovo apoptozo in staranje.. Tβ4 znatno poveča angiogeno sposobnost EPC, ki prikazuje odvisno od odmerka razmerje z največjim učinkom pri 1000 od/mL (v primerjavi s kontrolno skupino, 33.33±1,86 proti 18,34±2,02, p<0.05). Western blot analiza kaže, da Tβ4 spodbuja fosforilacijo Akt Ser473 in eNOS Ser1177, kaže tudi razmerje odvisno od odmerka. Akt siRNA in eNOS siRNA znatno zavirata proangiogene učinke Tβ4 na EPC.
- Zdravljenje kožnih ran
- Zdravljenje srčno-žilnih in možgansko-žilnih poškodb
- Zdravljenje oftalmoloških poškodb
- Druge aplikacije
Zaradi svojih bioloških funkcij, vključno s spodbujanjem migracije endotelijskih celic, preprečevanje celične apoptoze, protivnetni učinki, in spodbujanje razvoja lasnih mešičkov, Tβ4 ima tudi pomemben potencial pri negi kože, boj proti staranju kože, in spodbujanje ponovne rasti las, med drugimi vidiki zdravstvenega varstva.
