Pogosto zastavljena vprašanja
Preprosto v kompleks od miligramov do kilogramov
Zahteva za ponudbo po meri
How to store peptides?
Liofilizirani peptidi
Za dolgotrajno shranjevanje peptidov, priporočamo, da jih shranite kot trden prah. Liofilizirane peptide lahko shranite pri -20 °C ali nižje z minimalno razgradnjo. Strankam svetujemo, da vsak znova pregledajo prilagojene peptide 2 let od datuma izdaje kontrole kakovosti.
Peptidi v raztopini
Peptidi v raztopini so manj stabilni in nagnjeni k razgradnji. Vodne raztopine, ki se uporabljajo za raztapljanje peptidov, morajo biti sterilne in čiste.
V raztopini, določena količina peptida se lahko razgradi, odvisno od aminokislin, prisotnih v zaporedju. Spodaj je navedenih nekaj primerov:
– Peptidi, ki vsebujejo metionin, ostanki cisteina ali triptofana morajo imeti omejen čas shranjevanja v raztopini zaradi oksidacije. Te peptide je treba raztopiti v topilu brez kisika. –
Glutamin in asparagin se lahko deamidirata v glutaminsko kislino in asparaginsko kislino, oz. –
Cistein je lahko podvržen oksidativni ciklizaciji, da nastane cistein-cistein disulfidna vez (ki lahko nastanejo znotraj ali med disulfidnimi vezmi). –
Napolnjeni ostanki (asparaginska kislina, glutaminska kislina, lizin, arginin, histidin) so higroskopski (absorbiranje vode iz zraka) in nagnjeni k tvorbi viskoznosti, bistro olje. Ta fizična sprememba morda ne vpliva na naravo peptida. Priporočljivo je, da se takšni peptidi liofilizirajo, da se odstranijo sledi vode, nato razplinite z dušikom, da zagotovite, da v viali ni vodne pare, in nato hitro zamašimo.
Za preprečevanje poškodb zaradi ponavljajočega se zamrzovanja in odmrzovanja, priporočamo, da uporabniki raztopijo samo količino peptida, ki je potrebna za trenutni poskus. Presežek raztopine je treba shraniti pri ≥ -20 o C, dokler ni potrebno.
Izogibajte se vlagi.
Ker vlaga bistveno zmanjša dolgoročno stabilnost peptidov, priporočamo, da pred odpiranjem vial peptide uravnotežite v eksikatorju na sobno temperaturo. Po končanem razdeljevanju peptidov, preostale peptide v epruveti je treba nežno očistiti z brezvodnim dušikom, potem je treba posodo zapreti, zapečatena s tesnilno folijo, in shranjen pri -20°C.
Značilnosti topnosti različnih peptidov se precej razlikujejo. Ostanki, kot je alanin (Ala), cistein (Cys), izolevcin (z), levcin (Leu), metionin (Met), fenilalanin (Phe), in valin (Val) povečajo hidrofobnost in topnost peptida v vodnih raztopinah, in priporočljivo je, da stranka pri prilagajanju peptidov upošteva te smernice.
Lastnosti topnosti
Topnost peptidov je močno odvisna od zaporedja aminokislin. Naravno hidrofobni peptidi (A, F, G, V, L, jaz, M, W, P z večjo nagnjenostjo) zahtevajo organska topila za solubilizacijo. Kisli peptidi (večja nagnjenost k D, E v peptidnem zaporedju) zahtevajo osnovne vodne pufre za solubilizacijo, medtem ko bazični peptidi (večja nagnjenost k K, H, in R) zahtevajo kisle vodne pufre za solubilizacijo.
Izbira topila
Glede na omejitve vašega testa, priporočamo uporabo naslednjih smernic za določitev najboljšega topila za raztapljanje peptidov
Hidrofobni peptidi
Za ponovno raztapljanje hidrofobnih peptidov, dodati 100 µL DMSO in sonikirajte, dokler ne nastane homogena raztopina. Naprej, dodajte medpomnilnik po vaši izbiri, da naredite a 1 mg/ml raztopine (večja je koncentracija peptida, večja je potrebna količina DMSO).
Hidrofilna (Kislo) Peptidi
Za ponovno raztapljanje kislih peptidov, dodati 100 µL od 1% NH 4 OH do 1 mg peptida in vortex. Ko je raztopina bistra, dodajte medpomnilnik po vaši izbiri, da naredite a 1 mg/ml raztopine.
Hidrofilna (Osnovno) Peptidi
Za rekonstitucijo bazičnega peptida, dodajte destilirano vodo 1 mg peptida in vortex.
Kakšna je razlika med neto in bruto težo peptida?
Industrijski standard je dobava peptidov v liofilizirani obliki kot bruto teža. Bruto teža peptida je skupna teža vseh sestavin, prisotnih v liofiliziranem prašku. To vključuje peptid, ki nas zanima, vse peptidne nečistoče, vodo, ostanki topil, in protiion.
Ravno nasprotno Net teža peptida, izračunano iz Neto vsebnost peptidov, je teža samo peptid komponento, ki je prisotna v liofiliziranem prašku. To ponuja natančnejše koncentracije vaših naslednjih raztopin peptidov. Zato, smo priporočili količine neto teže peptidov za Peptid po meri naročila.
Neto vsebnost peptidov meritev se izvede z analizo aminokislin (AAA; omejena natančnost, vendar zahteva majhno količino materiala) ali elementarna analiza (CHN; zahteva miligrame peptida, vendar je bolj natančen). Obe metodi dajeta odstotno vrednost (tj., 75% neto vsebnost peptidov).
Neto vsebnost peptida je odvisna od količine prisotnega protiiona*, ki je odvisna od peptidnega zaporedja. V bistvu, večji je naboj peptida, nižja je vsebnost peptidov
*Opomba: Element, uporabljen za izračun neto vsebnosti peptida, temelji na peptidnem protiionu. To se naredi za zagotovitev, da protiion ne prispeva k vsebnosti peptida. Na primer, kadar sta TFA ali acetat protiion, dušik se uporablja, ker ga najdemo v peptidu, ne pa v TFA ali acetatu. Iz istega razloga se lahko uporabi ogljik ali dušik, kadar je klorid protiion.
Izračuni neto peptidne teže:
Neto količina peptida (skupni peptid) — metoda, ki jo uporabljamo za neto naročila peptidov po meri.
Pomnožite odstotek neto vsebnosti peptidov (decimalna oblika) z bruto težo peptida, da dobimo količino neto količine peptida (skupni peptid).
Na primer:
Za 5 mg bruto peptida/vialo:
Neto vsebnost peptidov je 84%.
Točna količina celotnega peptida = 0.84*5 mg=4,2 mg celotnega peptida
Neto količina zanimivega peptida – najbolj natančna — stranka lahko sama uporabi to metodo za izračun zanimivega peptida.
Pomnožite odstotek neto vsebnosti peptida z bruto maso peptida, in čistosti peptidov (s HPLC), za izračun natančne količine peptida, ki vas zanima. Neto odstotek peptida (decimalna oblika) se pomnoži s čistostjo peptida (decimalna oblika).
Na primer:
Za 5 mg bruto peptida/vialo s:
Neto vsebnost peptidov je 84%.
Točna količina peptida, ki nas zanima, je = 0.84*0.96*5 mg = 4,03 mg
Kakšno vrsto kemije uporabljate?
MOL Changes uporablja trdno fazno Fmoc kemijo namesto BOC kemije. Kemija Fmoc omogoča odstranitev zaščitnih skupin z uporabo blagih pogojev med elongacijo peptida, medtem ko kemija BOC zahteva uporabo močne kisline za odstranitev zaščitnih skupin med elongacijo peptida. Dodatno, Fmoc kemija uporablja trifluoroocetno kislino (TFA) za odstranitev peptida iz smole, medtem ko BOC kemija uporablja fluorovodikovo kislino (HF). HF je brezbarven, zelo jedko, in kontaktni strup.
Zato, MOL Changes uporablja kemijo Fmoc, saj je bolj blaga, prilagodljiv, in vsestranski v primerjavi s kemijo BOC.
Kako izračunam molarnost svojega peptida??
Molarnost se nanaša na molsko koncentracijo raztopine, kar je število molov raztopljene snovi 1 liter raztopine, izraženo kot mol/l, ali M.
Molarnost [M] = Masa / (Prostornina x molska masa); Mol = koncentracija (g/L) x Glasnost (L)/MW (g/mol)
Primer:
dano: 1mg suhega peptidnega praška z MW: 20KDa (Molska masa peptida je 20 g/mol)
Za določitev molarnosti z znano maso in znano prostornino
Za 1 ml raztopine tega peptida:
Molarnost = Masa (0.001g) / (glasnost (0.001L) x molska masa (MW 20,000) = 50 µM
Za določitev mase za dosego določene molarnosti:
Če za vaš test, potrebujete 0,01 mM raztopino delovnega peptida v 1 ml vode, nato izračunajte potrebno maso, kot sledi:
Masa = Molarnost x Prostornina x Molska masa
Masa = 0,01 mM x (1/1000 L) x 20.000 g/mol = 0,0002 g
Zato, za delovno raztopino 0,01 mM boste potrebovali 0,2 mg/ml peptida.
V kakšni obliki so dostavljeni peptidi?
Dobavljamo v obliki liofiliziranega ali surovega prahu in peptidne raztopine.
Kako naj vem, ali bo moj peptid topen??
Topnost peptida v danem topilu je odvisna od zaporedja aminokislin in jo je pogosto težko predvideti.. V primeru kataloških peptidov, informacije o topnosti so navedene na podatkovnem listu QC. Za peptide po meri, glejte razdelek z naslovom “Kako naj raztopim svoj peptid?”.
Kakšna je razlika med vsebnostjo peptidov in čistostjo peptidov?
Vsebnost peptidov ni pokazatelj čistosti peptidov, saj gre za dve ločeni meritvi. Čistost se določi z analitično HPLC in kaže na prisotnost/odsotnost drugih peptidnih kontaminantov (tj. okrnjeni peptidi).
Neto vsebnost peptida določa dejansko količino peptida (peptid, ki nas zanima, kot tudi peptidne kontaminante) prisoten v vzorcu. Neto vsebnost peptidov se tradicionalno meri z analizo aminokislin (AAA; omejena natančnost, vendar zahteva majhno količino materiala) ali elementarna analiza (CHN; zahteva miligrame peptida, vendar je bolj natančen).
Kako na splošno čistite svoje peptide?
Peptidi MOL Changes se običajno čistijo s preparativno HPLC z reverzno fazo, uporabo 2 pufri, ki vsebujejo 0.1% trifluoroocetna kislina (TFA). Prvi medpomnilnik (Medpomnilnik A) je sestavljen iz 0.1 % TFA v deionizirani vodi in drugi pufer (Medpomnilnik B) je sestavljen iz 0.1 % TFA v acetonitrilu (ACN).
Na splošno, surove peptide najprej raztopimo v raztopini pufra A, nekaj količine pufra B, ali organsko polarno topilo, kot je DMSO. Če je bilo uporabljeno organsko polarno topilo ali pufer B, to bistro raztopino bomo najprej razredčili s pufrom A. Naprej, peptidno raztopino filtriramo in naložimo na preparativni HPLC sistem. Uporaba optimiziranega gradienta metode, frakcije se nato zberejo na podlagi odčitkov absorbance. Vsaka frakcija se nato analizira z analitično HPLC, da se zagotovi, da čistost vsake frakcije ustreza zahtevani specifikaciji čistosti.
Te "čiste" frakcije se nato združijo in liofilizirajo. "Čisti" prašek se nato testira glede čistosti in identitete, da se zagotovi, da je bil proizveden pravi peptid.
Končno, neodvisna skupina za nadzor kakovosti pri AnaSpec ponovno testira peptid, da zagotovi, da vsi atributi testiranja ustrezajo zahtevanim specifikacijam.
Kako zapišem svoje konce peptidnega zaporedja?
Mednarodna nomenklatura, ki se uporablja za zaključke zaporedja, je naslednja:
– N-konec: H pomeni prosti amin (NH2-), Ac pomeni acetil [CH3C(O)-NH-], Pyr pomeni piroglutaminsko kislino
– C-terminal: OH pomeni prosta kislina (-COOH), NH2 pomeni amid [-CONH2]
– Spremembe na stranski verigi aminokislin so upodobljene v oklepaju za ustrezno aminokislino. Na primer; fosforiliran serin = S(PO3H2) ali epsilon-N-acetiliran lizin = K(Ac)
Med proizvodnjo peptidov, ioni v raztopinah za sintezo in čiščenje se vežejo na nabite stranske verige aminokislin peptida, tvorjenje soli. Ti ioni so znani kot peptidni protiioni in pomagajo uravnotežiti naboj peptida.
Trifluoroocetna kislina (TFA) se običajno uporablja pri sintezi in čiščenju peptidov.
Z bazičnimi aminokislinami tvori trifluoroacetatne soli (npr., lizin, arginin, histidin) in prosti N-terminalni amin. Zato, trifluoroacetat je običajno privzeti protiion.
Najmanjše število molekul TFA, vezanih na peptid, je sorazmerno s številom bazičnih ostankov v danem peptidnem zaporedju. torej, bolj bazični ostanki, ki so prisotni v peptidu, manjša je neto vsebnost peptidov v liofiliziranem prašku. Za upoštevanje vsebnosti TFA ali vode v vzorcu, priporočamo izvedbo testa vsebnosti peptidov za vsak peptid po meri.
Voda in trifluoroocetna kislina (TFA) so stranski produkti procesa čiščenja. Vendar, TFA lahko povzroči pomisleke glede toksičnosti za živ in predklinične študije. Zato, MOL Changes ponuja nestrupen acetat, klorid, ali izmenjevalci amonijeve soli.
hy so peptidi, ki vsebujejo Cys, Met, ali Trp težko sintetizirati?
Peptidi, ki vsebujejo Cys, Met, ali Trp je težko sintetizirati in pridobiti izdelke visoke čistosti. To je predvsem posledica nestabilnosti in dovzetnosti za oksidacijo teh funkcionalnih skupin. Pri uporabi in shranjevanju teh peptidov je potrebna posebna pozornost, da se prepreči ponavljajoče se odpiranje vial.
Ali smo spregledali vaše vprašanje?? Pišite nam in bomo
vrni se notri 24 ure.
