የML Peptide ትንበያዎችን ወደ ላቦራቶሪ-ዝግጁ ቅደም ተከተሎች በማገናኘት ላይ: ከትላልቅ-ባህሪ ሞዴሎች እና የንድፍ ጥናቶች ትምህርቶች
አመንጪ ሰው ሰራሽ የማሰብ ችሎታ, ስርጭት ስልተ ቀመር, እና ትልቅ ባህሪ ያላቸው የቋንቋ ሞዴሎች የፔፕታይድ ግኝትን አቅጣጫ ቀይረዋል. የስሌት መድረኮች በቢሊዮኖች የሚቆጠሩ እጩዎችን በሰዓታት ውስጥ መገምገም ይችላሉ።, ለግንኙነት እጩዎች ነጥብ መስጠት, ተቀባይ ምርጫ, እና የተተነበየ ሁለተኛ ደረጃ መዋቅር. ቢሆንም, ከሲሊኮ ስኬቶች ወደ አካላዊ የእርጥብ-ላብራቶሪ ሙከራ በሚሸጋገሩበት ጊዜ የምርምር ቡድኖች ብዙውን ጊዜ የስኬት ፍጥነት በከፍተኛ ሁኔታ ያጋጥማቸዋል።. በላይኛው ላይ የሚያስቆጥር በስሌት የተመቻቸ peptide 0.1% በጠንካራ-ደረጃ peptide ውህደት ወቅት የቨርቹዋል ስክሪን ሙሉ በሙሉ ሊሳካ ይችላል። (SPSS), በቲኤፍኤ ስንጥቅ ወቅት ድምር, ወይም በማጣሪያ ምርመራዎች ውስጥ የውሸት አዎንታዊ ምልክቶችን የሚያመነጩ የኮሎይድ ስብሰባዎችን ይፍጠሩ.
የማሽን መማር ትንበያዎችን ወደሚሞከር መተርጎም, ከፍተኛ-ንፅህና ያላቸው peptides በሙከራ የሚታወቅ ተከታታይ የመለያ ማዕቀፍ ያስፈልጋቸዋል. የስሌት ውጤቶችን እንደ የመጨረሻ እጩዎች ከመመልከት ይልቅ, መሪ የግኝት ቡድኖች የአካላዊ ስብሰባ ገደቦችን የሚገመግም ሁለተኛ ደረጃ የማኑፋክቸሪንግ ማጣሪያ ይተገብራሉ, ሊገመቱ የሚችሉ ማሻሻያ ኬሚስትሪዎችን ያስተዋውቃል, እና ሰፊ ባዮአሳይ ላይ ኢንቨስት ከማድረግዎ በፊት ባለ 4-ደረጃ ኦርቶጎን ማረጋገጫ ቧንቧ እጩዎችን ያስገዛል።.
ለምን የማሽን መማሪያ ሞዴሎች እርጥብ-ላብ ውድቀቶችን ያመነጫሉ።
ለ peptide ንድፍ አብዛኛዎቹ ጥልቅ የመማሪያ ሞዴሎች በጥሩ ጉልበት ወይም መዋቅራዊ ቦታ ላይ ይሰራሉ. በስታቲክ ፒዲቢ ኮ-ክሪስታል አወቃቀሮች ላይ የሰለጠኑ ስልተ-ቀመሮች ወይም የዝምድና መረጃ ለዒላማ መስተጋብር ሃይል ያመቻቻሉ, ኤሌክትሮስታቲክ ማሟያነት, እና የጀርባ አጥንት ዳይፐር መረጋጋት. ቢሆንም, እነዚህ ሞዴሎች በደረጃ አቅጣጫ የፔፕታይድ ሰንሰለት ማራዘም ኬሚካላዊ ፊዚክስን በጠንካራ ድጋፍ ላይ እምብዛም አያካትቱም።.
አንድ የስሌት ሞዴል 20-ሜር ወይም 30-ሜር ተከታታይ በሃይድሮፎቢክ ቀሪዎች የበለፀገ ሲያመነጭ, β-ሉህ የሚያስተዋውቁ ዘይቤዎች, ወይም ግዙፍ የጎን ሰንሰለቶች, የፔፕታይድ ስብስብ አካላዊ መካኒኮችን ይቃኛል. በ Fmoc ጠንካራ-ደረጃ peptide ውህደት ወቅት, እያደገ ያለው የፔፕታይድ ሰንሰለት ሲደርስ 8 ወደ 15 አሚኖ አሲዶች ርዝመት, የኢንተር-ሰንሰለት እና የውስጠ-ሰንሰለት ሃይድሮጂን ትስስር β-sheet ሁለተኛ ደረጃ መዋቅርን በቀጥታ በሬንጅ ማትሪክስ ላይ ሊያመጣ ይችላል. ይህ ክስተት, ሬንጅ ማሰባሰብ በመባል ይታወቃል, የሟሟ እብጠትን ይገድባል እና N-terminal amine ከሚመጡት ገቢር አሚኖ አሲዶች ይከላከላል.
የመነሻ ቁልፍ: ከፍተኛ የስሌት ትስስር ውጤቶች አካላዊ ውህደትን አያረጋግጡም።. ያልተጣሩ የማሽን መማሪያ ውጤቶች ብዙውን ጊዜ ሃይድሮፎቢክ እና β-ሉህ-አበረታች ቅሪቶችን ያተኩራሉ ይህም ከባድ የሬንጅ ውህደትን ያስከትላል, ያልተሟላ ትስስር, እና በጠንካራ-ደረጃ ውህደት ወቅት የተቆራረጡ ቆሻሻዎች.
የሬንጅ ማሰባሰብ በእርጥብ-ላብራቶሪ አፈፃፀም ውስጥ ወደ ሁለት ዋና ዋና የብልሽት ሁነታዎች ይመራል።:
- ያልተሟላ የ Fmoc መከላከያ: ኢንተር-ሰንሰለት ድምር ፒፔሪዲን ወደ N-terminal Fmoc ቡድን መድረስን ይገድባል. በወራጅ ውህደት ውስጥ, ይህ እንደ ጠፍጣፋ እና የሰፋ የአልትራቫዮሌት መከላከያ መገለጫዎች ያሳያል. በቡድን ውህደት, ያልተሟሉ መከላከያ ቅጠሎች ተቆርጠዋል, Fmoc የተጠበቀ, ወይም አሲቴላይትድ የጎን ምርቶች ከዒላማው peptide በዝግጅት ተቃራኒ-ደረጃ HPLC ለመለየት አስቸጋሪ ናቸው.
- የማጣመር Attenuation እና Steric መሰናክል: ግዙፍ ወይም ቻርጅ-ጥቅጥቅ ያሉ ተጓዳኝ ቀሪዎች (እንደ ተከታታይ Arg, ጋር, ቫል, ወይም Leu ቡድኖች) የአካባቢያዊ ስቴሪክ መጨናነቅ ይፍጠሩ. መደበኛ የቀለማት ማያያዣ ሙከራዎች, ኒንሃይሪን እና ቲኤንቢኤስን ጨምሮ, ብዙውን ጊዜ ከባድ የሬንጅ ውድቀት ከተከሰተ በኋላ የውሸት-አሉታዊ ውጤቶችን ይሰጣሉ, የጅምላ ስፔክትሮሜትሪ ሰፊ የስረዛ ቅደም ተከተሎችን እስኪያሳይ ድረስ ያልተመለሱ ሰንሰለቶችን መደበቅ.
የቁጥር ቅደም ተከተል የማምረት ማጣሪያዎች
የሞቱ-መጨረሻ ቅደም ተከተሎች ወደ ውህደት ቧንቧው እንዳይገቡ ለመከላከል, የኬሚካል ውህደቱ ከመጀመሩ በፊት የስሌት ስኬቶች በቁጥር ማጣሪያዎች ውስጥ ማለፍ አለባቸው.
እጩ ትውልድ (በሲሊኮን ውስጥ) → የማምረት አቅም & የድምር ማጣሪያ → የኬሚካል ማሻሻያ & የጥበቃ ስትራቴጂ → አካላዊ የ SPPS ስብሰባ → ደረጃ ያለው ባዮፊዚካል QC
1. የመስመር ውስጥ የኤፍሞክ መከላከያ & የመፍትሄው ድምር መለኪያዎች
የተዋሃደነት ማጣሪያ የታሪካዊ ፍሰት-ውህደት ዱካዎችን ከአካላዊ ኬሚስትሪ ህጎች ጋር ያጣምራል።. ሁለት ቁልፍ መለኪያዎች የመደመር አደጋን ያመለክታሉ:
- የመደመር ምክንያት (የ): ፍሰት ውህደት ውስጥ Fmoc መወገድ ጊዜ ውስጥ-መስመር UV ለመምጥ የተገኘ, በተከለከለው ጫፍ ስፋት እና ቁመቱ መካከል ያለው ልዩነት ተብሎ ይገለጻል። (AF = Wₙ - Hₙ). ኤኤፍ የሚያሳዩ ቅደም ተከተሎች > 20 ወይም የጥበቃ ጫፍ የሚበልጥ እየሰፋ ነው። 20% ከመጀመሪያዎቹ ዑደቶች አንፃር ከባድ የመዋሃድ አደጋ አላቸው።. ውስጥ እንደሚታየው በፔፕታይድ ውህደት ላይ የተፈጥሮ ኬሚስትሪ ጥናት (2026), የቅደም ተከተል ቅንብር እና የሃይድሮፎቢክ ስብስብ እነዚህን መከላከያ አኖማሊዎች ያንቀሳቅሳሉ.
- የመደመር መረጃ ጠቋሚ (AI): በሁለት የሞገድ ርዝመቶች ላይ UV spectrophotometry በመጠቀም የመፍትሄ-ግዛት ኮሎይድል ስብሰባን ይገመግማል: AI = (አ₃₅₀/አ₂₈₀ - አ₃₅₀) × 100 አንድ AI ከታች 3 ግልጽን ያመለክታል, ሞኖሜሪክ መፍትሄ. መካከል አንድ AI 3 እና 30 የብርሃን oligomerization ያንጸባርቃል, አንድ AI ከላይ ሳለ 30 በፈሳሽ ክሮማቶግራፊ እና በባዮሎጂካል ትንታኔዎች ላይ ጣልቃ የሚገባ የከባድ ኮሎይድ ውህደትን ያሳያል.
2. ሀይድሮፓቲቲቲ, ክስ, እና መዋቅራዊ ዝንባሌ
የቅደም ተከተል ቅንብር ሁለቱንም የSPPS አዋጭነት እና የውሃ መሟሟትን ይወስናል:
- ግራቪ (የሃይድሮፓቲቲቲ ግራንድ አማካይ): ከ GRAVY ነጥብ የሚበልጡ ቅደም ተከተሎች +0.4 በ HPLC ንፅህና ወቅት ከፍተኛ ሃይድሮፎቢክ እና ለዝናብ የተጋለጡ ናቸው።.
- ሃይድሮፎቢክ ትራይድስ: ተከታታይ ሃይድሮፎቢክ አሚኖ አሲዶች (ለምሳሌ., ምርጫ - ምርጫ - ምርጫ, ፌ-ኢሌ-ሉ, ትራፕ-ትራፕ-ቫል) በSPPS ጊዜ ፈጣን β-ሉህ ድምርን ያስነሳል።. የተከሰሱ ቀሪዎችን በማስገባት ላይ (ሊስ, አርግ, ግሉ) ወይም መዋቅርን የሚያበላሹ አሚኖ አሲዶች ይህንን ዝንባሌ ይቀንሳል.
- አይዞኤሌክትሪክ ነጥብ (ፒ.አይ) አሰላለፍ: ወደ ፊዚዮሎጂያዊ ቋት pH ቅርብ የሆነ ፒፒዲድስ (ፒኤች 7.0-7.4) በሴሎች ላይ በተመረኮዘ ሙከራ ወቅት ብዙውን ጊዜ ደካማ መሟሟትን ያሳያል.
3. የኬሚካላዊ አለመረጋጋት እና የጎን ምላሽ ምክንያቶች
ውህደቱ በሚፈጠርበት ጊዜ ድንገተኛ ብልሽት ለሚያጋጥማቸው የአሚኖ አሲድ ጥንዶች የስሌት ዲዛይኖች ኦዲት መደረግ አለባቸው።, መሰንጠቅ, ወይም ማከማቻ:
- አስፕ-ፕሮ ክሊቭጅ: በመደበኛ ጊዜ ፈጣን ራስ-ሰር ምርመራ የሚያደርጉ አሲድ-ላቢል ዲፔፕታይድ ቦንዶች 95% የቲኤፍኤ መሰንጠቅ.
- Asn-Gly እና Asp-Gly Aspartimide ምስረታ: በመሠረታዊ የ piperidine መከላከያ ሁኔታዎች ውስጥ የቀለበት መዘጋት የሱኪኒሚድ መካከለኛዎችን ያመጣል, ውጤት α- እና β-aspartyl የጎን ምርቶች.
- Met እና Trp ኦክሳይድ: የሜቲዮኒን ቅሪቶች በቀላሉ ወደ ሰልፎክሳይዶች ኦክሳይድ ያደርጋሉ, ትራይፕቶፋን ቲ-ቡታይላድ ወይም ፖሊሜሪክ የጎን ምርቶችን በቲኤፍኤ ስንጥቅ ሲፈጥር ከስካቬንገር ኮክቴሎች (ለምሳሌ., ኢዲቲ, thioanisole, ውሃ, phenol) ትክክል ያልሆነ ሚዛናዊ ናቸው.
- ኤን-ተርሚናል Gln ሳይክል: ግሉታሚን በአቀማመጥ 1 በአሲድ ወይም በገለልተኛ የማከማቻ ሁኔታዎች ውስጥ በድንገት ወደ ፒሮግሉታሜት ሳይክል ይጓዛል.
የቁጥር የማምረት ችሎታ ትሪያጅ ማትሪክስ
| መለኪያ / ባህሪ | ተስማሚ የዒላማ ክልል | ድንበር (ኬሚካላዊ እርዳታ ያስፈልገዋል) | ከፍተኛ ስጋት አለመቀበል ገደብ | እርጥብ-ላብራቶሪ ውጤት |
|---|---|---|---|---|
| ርዝመት (ቀሪዎች) | 5 – 25 አሚኖ አሲዶች | 26 – 40 አሚኖ አሲዶች | > 45 አሚኖ አሲዶች | የድፍድፍ ምርት ውስጥ ጉልህ ውድቀት; ከፍተኛ የመቁረጥ ፍጥነት |
| የGRAVY ነጥብ | -0.8 ወደ +0.2 | +0.2 ወደ +0.5 | > +0.5 | ከባድ የውሃ መሟሟት; የመንጻት ውድቀት |
| የመደመር ምክንያት (የ) | < 10 | 10 – 20 | > 20 | ጠፍጣፋ የFmoc መከላከያ ቁንጮዎች; ምላሽ ያልተሰጡ አሚኖ አሲዶች |
| አይዞኤሌክትሪክ ነጥብ (ፒ.አይ) | < 5.5 ወይም > 8.5 | 5.8 – 6.5 ወይም 7.8 – 8.2 | 6.8 – 7.5 | በፊዚዮሎጂያዊ ቋቶች ውስጥ የኢዮኤሌክትሪክ ዝናብ |
| የሳይሲስ ይዘት | 0 – 2 ቀሪዎች | 3 – 4 ቀሪዎች (ተቆጣጠረ) | > 4 ያልተጣመረ Cys የፔፕታይድ ውህደት | የተሳሳተ የዲሰልፋይድ ድልድዮች; ኦክሳይድ ኦሊጎሜራይዜሽን |
| ጥበቃ ያልተደረገለት ተገናኘ / ትራፕ | 0 ቀሪዎች | 1 ተረፈ (አጭበርባሪ ያስፈልጋል) | ≥ 2 ቀሪዎች | በቲኤፍኤ ስንጥቅ ጊዜ ፈጣን ኦክሲዴሽን እና የስብስብ ምስረታ |
በሲሊኮ ትንበያ vs. አካላዊ እርጥብ-ላብ እውነታ
<በሲሊኮ ማመቻቸት ትኩረት ኮድ Peptides አቅራቢ”>የባህሪ ጎራ
በሲሊኮ ማመቻቸት ትኩረት
የአካላዊ እርጥብ-ላብ ገደብ / አለመሳካት ሁነታ
ተግባራዊ የመቀነስ ስልት
<ዝቅተኛ ምትክ የPEG ሙጫዎችን እና ትርምስ ተጨማሪዎችን ይጠቀሙ (LiCl/DMF) Ch Peptide(አርግ, ጋር, ቫል)
| ሁለተኛ ደረጃ መዋቅር | α-helixን ከፍ ያደርገዋል / በዒላማ ማሰሪያ ቦታ ላይ β-ሉህ መረጋጋት | የኢንተር-ሰንሰለት β-ሉህ ድምር በቀጥታ በሬንጅ ድጋፍ ላይ | pseudoproline dipeptides ወይም የጀርባ አጥንት መከላከያ ቡድኖችን አስገባ (ዲኤምቢ/Hmb) |
| የተረፈ ሃይድሮፎቢሲዝም | ለከፍተኛ ትስስር የሃይድሮፎቢክ ኮርሶችን ያሽጉ | ዝቅተኛ የውሃ መሟሟት, የ HPLC ዝናብ, እና አምድ መበከል | የሂሳብ ክፍያ ስርጭት; የዋልታ solubilizing መለያዎችን ማካተት |
| ሰንሰለት ማራዘም | ያለ ስቴሪክ ማገጃ የመስመር ተከታታይ መደመርን ያስባል | ዝቅተኛ ምትክ የPEG ሙጫዎችን እና ትርምስ ተጨማሪዎችን ይጠቀሙ (LiCl/DMF) | |
| Peptide ሻጭ የዒላማ ቅርርብ | ΔG እና አስገዳጅ ኪኔቲክስን በጥሩ ሞኖሜሪክ ሁኔታ አስመዘገበ | ልዩ ያልሆነ የኮሎይድ እራስን መሰብሰብ ሴሰኛ ትስስርን ይፈጥራል | በዲኤልኤስ በኩል የመፍትሄውን ሁኔታ አሃዳዊነት ያረጋግጡ (ፒዲአይ <0.15) & SEC-MALS |
ሊገመቱ የሚችሉ ማሻሻያ ኬሚስትሪ እና ሰው ሠራሽ እርዳታዎች
የስሌት ተስፋ ሰጭ ቅደም ተከተል የድንበር ማምረት አቅምን ሲያሳይ, ተመራማሪዎች ጥቃቱን ሙሉ በሙሉ ማስወገድ አያስፈልጋቸውም. ኬሚካላዊ ባዮሎጂ በSPPS ጊዜ የሁለተኛ ደረጃ መዋቅርን በጊዜያዊነት የሚያውኩ ወይም የላብራቶሪ አያያዝን ቅደም ተከተል የሚያረጋጋ መዋቅራዊ ጣልቃገብነቶችን ያቀርባል.
1. Pseudoproline Dipeptides እና የጀርባ አጥንት መከላከያ ቡድኖች
በሰንሰለት ማራዘሚያ ወቅት የሬንጅ ማሰባሰብን ለመከላከል, የተቀናጀ ኬሚስቶችን ለማስተዋወቅ ተመለስኩ።
Pseudoproline Dipeptides: እንደ Fmoc-Xaa-Thr ያሉ የሴሪን ወይም የ Threonine oxazolidine ተዋጽኦዎችን በማካተት(Ψᵐᵉ˒ᵐᵉpro)-OH ወይም Fmoc-Xaa-Ser(Ψᵐᵉ˒ᵐᵉpro)-ኦኤች - በፔፕታይድ ቦንድ ላይ የሲስ-ኮንፎርሜሽን አስተዋውቋል. ይህ ኪንክ በSPPS ጊዜ እንደ β-sheet breaker ይሰራል, የሬን እብጠትን መጠበቅ. በመጨረሻው የቲኤፍኤ መከፋፈል ላይ, የ oxazolidine ቀለበት ቤተኛ Ser ወይም Thr ለማምረት በቁጥር ይከፈታል።. Peptide
n የመጨረሻ TFA cleavage, የ oxazolidine ቀለበት ቤተኛ Ser ወይም Thr ለማምረት በቁጥር ይከፈታል።.
- N-Dmb እና N-Hmb የጀርባ አጥንት ጥበቃ: እንደ N- ያሉ ተዋጽኦዎች(2,4-ዲሜትሆክሲቤንዚል) (ዲምቢ) ወይም N-(2-hydroxy-4-methoxybenzyl) (ሃምብ) በጀርባ አጥንት ላይ የአሚድ ፕሮቶኖችን ይተኩ, ውህደትን የሚያንቀሳቅሰውን የኢንተር-ሰንሰለት ሃይድሮጂን ትስስር ኔትወርክን ማስወገድ.
ለጠቃሚ ምክር: ከረጅም ጊዜ በላይ የስሌት ንድፎችን ሲያቀናጅ 20 የሃይድሮፎቢክ ጎራዎችን የያዙ ቀሪዎች, የ pseudoproline dipeptides ወደ ቤተኛ Xa-Ser ወይም Xaa-Thr ቦታዎች ለማስገባት አስቀድመው ያቅዱ. ይህ ነጠላ ማሻሻያ ሙሉ በሙሉ ሊጣመር የማይችል ቅደም ተከተል ወደ ከፍተኛ ምርት ውህድነት ሊለውጠው ይችላል።.
</ኮ
Ghp Peptide ኩባንያ Pseudoproline ጣልቃ ገብነት
rowspan=”1″>
ንጥል
| ዝርዝር | |
|---|---|
| ቤተኛ የመደመር ቅደም ተከተል | ኤች-ሉ-ቫል-ቫል-ኢሌ-ትህር-ሉ-ቫል-ግሊ-ኦህ (ከፍተኛ ሬንጅ ስብስብ) |
| Pseudoproline ጣልቃ ገብነት | ኤች-ሉ-ቫል-ቫል-ኢሌ-[Thr(Ψᵐᵉ˒ᵐᵉpro)]-ሉ-ቫል-ግሊ-ኦህ (የተበላሸ β-ሉህ መዋቅር) |
| የድህረ-TFA የመቁረጥ ምርት | ኤች-ሉ-ቫል-ቫል-ኢሌ-ትህር-ሉ-ቫል-ግሊ-ኦህ (የቤተኛ ዒላማ ቅደም ተከተል) |
2. ሬንጅ አርክቴክቸር እና የማሟሟት ስርዓት ማመቻቸት
የአካል ድጋፍን ከተከታታይ ባህሪያት ጋር ማዛመድ ለአስቸጋሪ peptides ወሳኝ ነው።:
- ዝቅተኛ-ተተካ PEG Resins: ባህላዊ የ polystyrene ሙጫዎች በከፍተኛ ምትክ (0.6-1.0 mmol/g) ለረጅም ወይም የተዋቀሩ peptides ፈጣን የስትሮክ መጨናነቅ ያስከትላሉ. ወደ ፖሊ polyethylene glycol ላይ የተመሰረቱ ድጋፎችን መቀየር (ለምሳሌ., ተንታጌል, NovaPEG, PEGA) ዝቅተኛ የመተካት ተመኖች ጋር (0.15-0.25 mmol/g) የሬንጅ እብጠት መጠን ይጨምራል እና ወደ መጋጠሚያ ቦታዎች ክፍት መዳረሻን ያቆያል.
- ቻኦትሮፒክ ተጨማሪዎች እና የተቀላቀሉ ፈሳሾች: እንደ LiCl ያሉ የተዘበራረቁ ጨዎችን መጨመር (0.8 ኤም በዲኤምኤፍ) ወይም መደበኛ ዲኤምኤፍን በ NMP መተካት, ዲኤምኤ, ወይም DMSO የያዙ ሁለትዮሽ ድብልቆች በአስቸጋሪ የማጣመር ደረጃዎች ውስጥ ያልተጣመሩ ስብስቦችን ያበላሻሉ.
3. የባዮ-ኦርቶጎን ውህደት እና ሳይክል
ማሻሻያዎች በሚገመተው ላይ መታመን አለባቸው, ልዩ ያልሆኑ የጎንዮሽ ጉዳቶችን የሚያስወግዱ ከፍተኛ ምርት የሚሰጡ ኬሚስትሪ:
- ኬሚስትሪን ጠቅ ያድርጉ (SPAAC & CuAAC): ለጣቢያ-ተኮር መለያ, አዚድ የተሸከሙ ቀኖናዊ ያልሆኑ አሚኖ አሲዶች ውህደት (ለምሳሌ., ኤል-አዚዶሆሞአላኒን) ወይም አልኪን መያዣዎች ከመዳብ ነፃ የሆነ ውጥረትን የሚያስተዋውቅ አዚድ-አልኪን ሳይክሎድዲሽን ይፈቅዳል (SPAAC) በ DBCO-functionalized fluorophores, ባዮቲን, ወይም PEG ሰንሰለቶች በትንሽ የውሃ ሁኔታዎች ውስጥ.
- ስቴፕሊንግ እና ሳይክል ማድረግ: የተተነበዩ የ α-helical conformations ለመቆለፍ, የሃይድሮካርቦን ስቴፕሊንግ ቀለበት በሚዘጋ ሜታቴሲስ በኩል (RCM) ወይም የላክቶም ድልድይ በሊስ እና አስፕ/ግሉ ቅሪቶች መካከል ያለው ዑደት የባዮአክቲቭ ኮንፎርሜሽን በሚስተካከልበት ጊዜ የፕሮቲን መረጋጋትን እና የሕዋስ ቅልጥፍናን ያሻሽላል።.
ደረጃ ያላቸው ኦርቶጎን የማረጋገጫ ምእራፎች
በኮምፒውቲሽናል ፔፕታይድ ግኝት ውስጥ ዋነኛው ችግር ጥሬ ሰው ሰራሽ ንክኪዎችን በቀጥታ ወደ ከፍተኛ ማሰሪያ ወይም ሴል ላይ የተመሰረቱ ሙከራዎችን ማድረግ ነው።. ደካማ-ንፅህና ናሙናዎች, መቆራረጥ ምርቶች, ቀሪ TFA, እና colloidal aggregates በተደጋጋሚ የውሸት አወንታዊ እንቅስቃሴን ይፈጥራሉ.
በሲሊኮን ምቶች ውስጥ አስተማማኝ እንዲሆኑ ለማድረግ, ሊሞከር የሚችል ሳይንሳዊ እርሳሶች, የግኝት ፕሮግራሞች ባለ 4-ደረጃ ኦርቶጎን ማረጋገጫ ፍኖተ ካርታ መተግበር አለባቸው.
ወሳኝ ምዕራፍ 1: ያልተነካ ቅዳሴ & ንጽህና (HR-ESI-MS / RP-HPLC ≥95%)
ወሳኝ ምዕራፍ 2: Monodispersity & የመፍትሄው ሁኔታ (DLS ፒዲአይ <0.15 / SEC-MALS) ወሳኝ ምዕራፍ 3: የሁለተኛ ደረጃ መዋቅር የንጽህና ማረጋገጫ (የሩቅ-UV ሲዲ 190-250 nm) ወሳኝ ምዕራፍ 4: ቀጥተኛ የኪነቲክ ማሰሪያ (SPR / የእውነተኛ ጊዜ ዳሳሾች ይሁኑ)
ወሳኝ ምዕራፍ 1: ያልተነካ የጅምላ እና የንጽህና ማረጋገጫ (LC-MS)
- የትንታኔ ግብ: አካላዊ ቁሱ ከተነደፈው ቅደም ተከተል ትክክለኛ የአቶሚክ ስብጥር ጋር የሚዛመድ እና አነስተኛ የንጽህና ገደቦችን ያሟላ መሆኑን ያረጋግጡ።.
- ዘዴ: ከፍተኛ-ጥራት ESI-TOF ወይም Orbitrap ፈሳሽ chromatography-mass spectrometry (LC-MS) በአዎንታዊ ion ሁነታ የሚሰራ, ከ Ultra-Performance RP-HPLC ጋር የተጣመረ የC18 አምድ እና ሀ 0.1% TFA ውሃ/አሴቶኒትሪል ቅልመት.
- ተቀባይነት መስፈርቶች: ትክክለኛ የጅምላ ስህተት ≤ 5 ፒፒኤም; ክሮሞግራፊክ ንፅህና ≥ 95% በ UV ጫፍ አካባቢ ውህደት በ 214 nm እና 280 nm; የተቆራረጡ የስረዛ ቅደም ተከተሎች ወይም ያልተጠበቁ የጥበቃ ቡድኖች አጠቃላይ አለመኖር. ውስጥ በዝርዝር እንደተገለጸው የ PMC ባዮፊዚካል ቀደምት መድሃኒት ግኝት ፕሮቶኮል (2020), ጥብቅ የጅምላ ማረጋገጫ ለሁሉም የታችኛው ጅረት ባዮፊዚካል ግምገማዎች ለድርድር የማይቀርብ መግቢያ በር ነው.
ወሳኝ ምዕራፍ 2: የመፍትሄ ባህሪ እና Monodispersity (DLS & SEC-MALS)
- የትንታኔ ግብ: ፔፕታይድ በፊዚዮሎጂ ቋት ውስጥ ሞኖ መከፋፈሉን እና ልዩ ያልሆኑ የኮሎይድ ውህዶች አለመሥራቱን ያረጋግጡ ሴሰኛ ክልከላ ወይም የውሸት ትስስር.
- ዘዴ: ተለዋዋጭ የብርሃን መበታተን (DLS) የሃይድሮዳይናሚክ ራዲየስ መለካት (አር ₕ) በማጎሪያ ቅልመት ላይ (10 µM ወደ 1 ኤምኤም), በመጠን ማግለል የተደገፈ Chromatography ከብዙ አንግል ብርሃን መበተን ጋር ተጣምሯል። (SEC-MALS).
- ተቀባይነት መስፈርቶች: የ polydispersity መረጃ ጠቋሚ (ፒዲአይ) < 0.15; ነጠላ ሲሜትሪክ ጫፍ በSEC-MALS ላይ ከተሰላ ሞኖሜሪክ ጋር ይዛመዳል (ወይም ሆን ተብሎ ዲሜሪክ) ሞለኪውላዊ ክብደት; በጊዜ ላይ የተመሰረተ ቅንጣት አያድግም። 24 ሰዓቶች በ 25 ° ሴ.
ማስጠንቀቂያ: የኦፕቲካል ወይም የገጽታ ማሰሪያ ሙከራዎችን ከማድረግዎ በፊት DLS ወይም SEC-MALS በጭራሽ አይዝለሉ. ንዑስ-ማይክሮን ኮሎይድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድድመት ወይም ዳሳሽ ቺፕስ., በ monodisperse መቆጣጠሪያዎች ላይ ሲሞከሩ የሚጠፉ ሰው ሰራሽ ናኖሞላር ተዛማጅ ምልክቶችን ማመንጨት.
ወሳኝ ምዕራፍ 3: የሁለተኛ ደረጃ መዋቅር እና ታጣፊ የንፅህና ማረጋገጫ (ሲዲ ስፔክትሮስኮፒ)
- የትንታኔ ግብ: የተቀናጀው peptide በአልፋፎልድ የተተነበየውን ሁለተኛ ደረጃ መዋቅር መቀበሉን ይወስኑ, ሮዝታ, ወይም አመንጪ ሞዴሎች.
- ዘዴ: የሩቅ-UV ክብ ዲክሮይዝም (ሲዲ) spectroscopy ከ ተመዝግቧል 190 nm ወደ 250 nm በ quartz cuvettes (1 ሚሜ ርዝመት) በተለያዩ ቋት ሁኔታዎች ውስጥ, ሙቀቶች, እና ሽፋንን የሚመስሉ አካባቢዎች (ለምሳሌ., TFE ወይም SDS ሚሴሎች).
- ተቀባይነት መስፈርቶች: የተለዩ የእይታ ፊርማዎች ከተገመቱ እጥፋቶች ጋር ይዛመዳሉ:
- α-ሄሊክስ: ድርብ ሚኒማ በ 208 nm እና 222 nm, በአዎንታዊ ጫፍ አቅራቢያ 190 nm.
- β-ሉህ: ነጠላ አሉታዊ ዝቅተኛ በ 218 nm እና አዎንታዊ ጫፍ በአቅራቢያ 195 nm.
- የዘፈቀደ ጥቅልል: አሉታዊ ዝቅተኛ ቅርብ 198 nm (በመፍትሔው ውስጥ ያልተዋቀረ ስምምነትን የሚያመለክት).
ወሳኝ ምዕራፍ 4: ቀጥተኛ የኪነቲክ ማሰሪያ እና ተግባራዊ ግምገማ (SPR / ሁን)
- የትንታኔ ግብ: የእውነተኛ ጊዜ አስገዳጅ ኪኔቲክስን ይቁጠሩ (የማህበሩ መጠን kₒₙ, የመለያየት መጠን kₒff, እና ሚዛናዊ መለያየት ቋሚ ኬ ዲ) ከተፈለገው ፕሮቲን ጋር.
- ዘዴ: Surface Plasmon Resonance (SPR) ወይም Bio-Layer Interferometry (ሁን). የዒላማ ፕሮቲኖች በአሚን ማጣመር ወይም በሳይት-ተኮር ባዮቲኒሌሽን ወደ ሴንሰር ቺፕስ አይንቀሳቀሱም።. ፔፕቲድስ ከ0.1× K D እስከ 10× K D በሚሸፍነው ባለብዙ-ማጎሪያ ተከታታዮች ውስጥ ገብተዋል።.
- ተቀባይነት መስፈርቶች: በማተኮር ላይ የተመሰረተ, ሊጠጉ የሚችሉ ዳሳሾች ፊቲንግ ሀ 1:1 Langmuir አስገዳጅ ሞዴል; ባለሁለት ቻናል ማመሳከሪያ ሰርጥ መቀነስ ከማትሪክስ ጋር ዜሮ ልዩ ያልሆነ ትስስርን ያረጋግጣል; በኪነቲክ ኬ ዲ መካከል ስምምነት (kₒff / kₒₙ) እና ቋሚ-ግዛት ዝምድና ስሌቶች.
ውስብስብ ውህድ እና ሂደት ልኬት አጋርነት
የማሽን መማር ትንበያዎችን ወደ ላቦራቶሪ-ዝግጁ ቅደም ተከተሎች መተርጎም በስሌት ባዮሎጂ እና በልዩ የፔፕታይድ ኬሚስትሪ እውቀት መካከል ጥብቅ ቅንጅት ይጠይቃል።. የውስጥ እርጥብ-ላብራቶሪ አቅም ወይም ውህድ መሳሪያዎች አስቸጋሪ ቅደም ተከተሎችን መቆጣጠርን ሲገድቡ, ከተወሰነ የምርምር ውህደት መድረክ ጋር በመተባበር የአፈፃፀም ክፍተቱን ያስተካክላል.
በ MOL ለውጦች, ለላቀ ባዮቴክ ከኮምፒውቲሽናል-ወደ-ላብራቶሪ ክፍፍሉን በማገናኘት ላይ ልዩ ነን, ፋርማሲዩቲካል, እና የአካዳሚክ ምርምር ቡድኖች:
- ብጁ ቅደም ተከተል ልዩነት & SPSS: ውስብስብ የባለሙያ አፈፃፀም, ሃይድሮፎቢክ, ወይም ለአስቸጋሪ ዲዛይኖች የተበጁ ልዩ ጠንካራ-ደረጃ እና ፍሰት ውህደት ቴክኖሎጂዎችን በመጠቀም ለስብስብ የተጋለጡ ቅደም ተከተሎች።. በከፍተኛ-GRAVY በቤንችማርክ ሙከራዎች (>+0.4) የስሌት ንድፎች, የእኛ ንቁ pseudoproline dipeptide ስትራቴጂ የተሻሻለው አማካኝ ድፍድፍ ጥንቅር ምርት <15% ወደላይ 82%.
- ክፍል 100 እጅግ በጣም የጸዳ የጽዳት ክፍልን በመስራት ላይ: ለሴል-ተኮር, ኦርጋኖይድ, ወይም Vivo መተግበሪያዎች ውስጥ, peptides የተቀናጁ እና በክፍል ውስጥ ይከናወናሉ 100 የጸዳ አካባቢዎች, ጥብቅ የፅንስ መቆጣጠሪያዎችን እና ዋስትና ያለው ዝቅተኛ-ኢንዶቶክሲን ሂደትን ያቀርባል (< 0.01 EU/mg).
- ሰፊ የማሻሻያ ፖርትፎሊዮ: በላይ መድረስ 300 ተግባራዊ ማሻሻያዎች, ቀኖናዊ ያልሆኑ አሚኖ አሲዶችን ጨምሮ, pseudoproline dipeptides, ጣቢያ-ተኮር ጠቅታ መያዣዎች, የፍሎረሰንት መለያዎች, እና የተረጋጋ isotope መለያ.
- ኦዲት-ዝግጁ ትንታኔ QC: እያንዳንዱ የተላከ peptide ሁሉን አቀፍ ያካትታል, ባች-ተኮር ሰነዶች-ተያይዘዋል። ባች-ተኮር የ HPLC chromatograms እና የጅምላ እይታ ማንነትን ዋስትና ለመስጠት, ከፍተኛ ንጽሕና (≥95%), እና ብዙ-ወደ-ሎጥ ወጥነት ያጠናቅቁ.
በሲሊኮ Peptide ትርጉም ውስጥ ተግባራዊ ሊደረግ የሚችል ዝርዝር
የማሽን መማሪያ ትንበያዎችን ወደ ሚፈተኑ የላቦራቶሪ ንብረቶች ሽግግር ደረጃውን የጠበቀ ለማድረግ, የሚከተለውን የአሠራር ማረጋገጫ ዝርዝር ተጠቀም:
- የቅድመ-ስነሲስ ቅደም ተከተል ኦዲት
- የGRAVY ነጥብ አስላ, isoelectric ነጥብ, እና የመደመር ምክንያት (የ).
- ባንዲራ አስፕ-ፕሮ, አስን-ግሊ, እና ያልተጠበቁ የሜት/Trp ዘይቤዎች ለኬሚካል ቅነሳ.
- አጠቃላይ ርዝመት እና የተጣራ ክፍያ በ assay pH ሁኔታዎች ያረጋግጡ.
- ሰው ሠራሽ ስትራቴጂ ምርጫ
- ዝቅተኛ-ተተካ PEG ሙጫዎችን ይምረጡ (0.15-0.25 mmol/g) ለቅደም ተከተሎች > 20 ቀሪዎች.
- በሃይድሮፎቢክ ክልሎች ውስጥ ባሉ የ Xaa-Ser/Thr ጣቢያዎች ላይ pseudoproline dipeptides ቀድመው ያስገቡ።.
- oxidation-sensitive ተረፈዎችን ለያዙ ቅደም ተከተሎች ስካቬንገር ኮክቴሎችን ያቅዱ.
- የደረጃ ላብራቶሪ ማረጋገጫ
- ያልተነካ የጅምላ መጠን በከፍተኛ ጥራት ESI-MS ያረጋግጡ (ስህተት ≤ 5 ፒፒኤም) እና ንጽሕና (≥ 95% በ HPLC).
- ሞኖዳይፐረሲቲን በዲኤልኤስ ይገምግሙ (ፒዲአይ < 0.15) አስገዳጅ ጥናቶችን ከመጀመሩ በፊት.
- የተተነበየውን መታጠፍ በ Far-UV CD spectroscopy ያረጋግጡ.
- የ SPR/BLI ኪነቲክ ማሰርን ከባለሁለት ቻናል ማጣቀሻ መቀነስ ጋር ያከናውኑ.
