Επισκόπηση
Thymosin beta 4 (Tβ4) είναι μια πρωτεΐνη μικρού μορίου που αποτελείται από πολλά υπολείμματα αμινοξέων και είναι ευρέως κατανεμημένη σε διάφορους ιστούς και κύτταρα του ανθρώπινου σώματος.[1][2] Ως ένα από τα κύρια μόρια ρύθμισης της ακτίνης στο ανθρώπινο σώμα, έχει πολλαπλές βιολογικές λειτουργίες και παίζει καθοριστικό ρόλο στην αναγέννηση των ιστών, αναδιαμόρφωση, επούλωση πληγών, διατήρηση της ισορροπίας της ακτίνης, ανάπτυξη όγκου και μετάσταση, απόπτωση των κυττάρων, φλεγμονή, αγγειογένεση, ανάπτυξη τριχοθυλακίων, και άλλες φυσιολογικές και παθολογικές διεργασίες.
Βιολογικές Λειτουργίες και Μηχανισμοί Δράσης
Η Τβ4 είναι ένα από τα κύρια μόρια που ρυθμίζουν την ακτίνη στο ανθρώπινο σώμα και έχει πολλαπλές βιολογικές λειτουργίες, παίζει σημαντικό ρόλο στην αναγέννηση των ιστών, αναδιαμόρφωση, επούλωση πληγών, διατήρηση της ισορροπίας της ακτίνης, ανάπτυξη όγκου και μετάσταση, απόπτωση των κυττάρων, φλεγμονή, αγγειογένεση, ανάπτυξη τριχοθυλακίων, και άλλες φυσιολογικές και παθολογικές διεργασίες.
- Ρυθμιστικός παράγοντας ακτίνης: Η Actin αντιπροσωπεύει περίπου 10% της ολικής πρωτεΐνης στα μη μυϊκά κύτταρα και είναι απαραίτητο συστατικό που απαιτείται για τη δομή των κυττάρων, κίνηση των κυττάρων, και επούλωση πληγών. Η παρουσία του Τβ4 στα κύτταρα είναι επαρκής για την απομόνωση όλων των μονομερών ακτίνης και τη συμμετοχή στη ρύθμιση του πολυμερισμού και του αποπολυμερισμού της ακτίνης. Το Τβ4 μπορεί να συνδεθεί με μονομερή ακτίνης σε α 1:1 αναλογία, αποτρέποντας το σχηματισμό πολυμερών F-ακτίνης. Η δέσμευση του Τβ4 στην ακτίνη συνοδεύεται από τη διάσταση του δεσμευμένου νερού. Το C-τελικό του Τβ4 συνδέεται με την ακτίνη His-40, προκαλώντας μια διαμορφωτική αλλαγή στα μονομερή της ακτίνης. Το μόριο Τβ4 περιέχει μια περιοχή δέσμευσης ακτίνης (ΚΛΕΙΔΩΜΕΝΟ), που είναι η κύρια θέση ηλεκτροστατικής επαφής. Το Ν-τερματικό του θραύσμα μπορεί να αναστείλει τον πολυμερισμό της ακτίνης μέσω στερικής παρεμπόδισης. Όταν ενεργεί μόνος, Το Τβ4 μπορεί να αναστείλει τον πολυμερισμό της ακτίνης και την ανταλλαγή νουκλεοτιδίων στην ακτίνη. Αυτό έρχεται σε αντίθεση με το ρόλο μιας άλλης πρωτεΐνης που δεσμεύει την ακτίνη, Προφίλ, που προωθεί την ανταλλαγή ADP και ATP, επιταχυνόμενη συναρμολόγηση ακτίνης. [1][2]Το Tβ4 και το Profilin μπορούν να ρυθμίσουν συνεργιστικά τη συναρμολόγηση της ακτίνης. Η Τβ4 μπορεί να ρυθμίσει τη μετατροπή μεταξύ G-ακτίνης και F-ακτίνης. Έχει αναφερθεί ότι η συγκέντρωση της Τβ4 φτάνει 300 pmol σε αιμοσφαίρια υψηλής κινητικότητας, ενώ η συγκέντρωση που απαιτείται για τη σύνδεση του Τβ4 με την G-ακτίνη είναι μικρότερη από 20 pmol. Με αύξηση της συγκέντρωσης, Η Τβ4 μειώνει την ικανότητα αποπολυμερισμού της F-ακτίνης. Αυτός μπορεί να είναι ο λόγος για τον οποίο η Τβ4 ρυθμίζει τη λειτουργία του συστήματος κυτταρικών μικρονημάτων.
Προώθηση μετανάστευσης και αγγειογένεσης ενδοθηλιακών κυττάρων: Μελέτες που χρησιμοποιούν τη χοριοαλλαντοϊκή μεμβράνη του κοτόπουλου (ΕΚΚΕΝΤΡΟ) μοντέλο αγγειογένεσης έχουν δείξει ότι όταν τα ενδοθηλιακά κύτταρα διαφοροποιούνται σε σωληναριακές δομές, η περιεκτικότητα σε mRNA του Τβ4 αυξάνεται κατά πέντε φορές, και η επιμόλυνση με Τβ4 επιταχύνει τον σχηματισμό δομών που μοιάζουν με σωλήνα σε κλώνους ενδοθηλιακών κυττάρων. Επιπλέον, Η έρευνα έχει βρει ότι η Τβ4 μπορεί να αλληλεπιδράσει με το ινώδες και το κολλαγόνο με τη μεσολάβηση της τρανσγλουταμινάσης (Παράγοντας XIIIa) και παίζουν σημαντικό ρόλο στη διαδικασία της πήξης του αίματος. Επί πλέον, σε ένα πείραμα πλήρους πάχους τραυματισμού δέρματος σε ηλικιωμένα διαβητικά ποντίκια, Το Tβ4 μπορεί να επιταχύνει την επούλωση δερματικών πληγών μεγάλης περιοχής και βαθιά εγκαύματα, προάγει την αποκατάσταση του δέρματος και του κερατοειδούς, και επιδεικνύουν την ικανότητα να επιταχύνουν την επούλωση των πληγών.
Αναστολή της κυτταρικής απόπτωσης: Η Τβ4 έχει σημαντική προστατευτική δράση στα επιθηλιακά κύτταρα του κερατοειδούς που έχουν υποστεί βλάβη από διαβρωτικές ουσίες όπως το χλωριούχο βενζαλκόνιο ή η αιθανόλη. Η ανοδική ρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου Τβ4 είναι ευεργετική για την ενίσχυση της αντίστασης των κυττάρων στην υποξία.[2][3]
Υπορρύθμιση βασικών φλεγμονωδών μορίων: Η επούλωση πληγών είναι μια πολύπλοκη βιολογική διαδικασία που μπορεί να χωριστεί σε τρία διακριτά στάδια: φλεγμονή, πολλαπλασιασμός των κυττάρων, και αναδιαμόρφωση ιστών, με τη γονιδιακή έκφραση των σχετικών πρωτεϊνών να ρυθμίζεται προς τα πάνω και στη συνέχεια να μειώνεται σε κάθε στάδιο. Για χρόνιες πληγές, αυτή η ρυθμιστική διαδικασία μπορεί να διαταραχθεί από παράγοντες όπως η ηλικία, υποκείμενες ασθένειες, και ανοσοκατασταλτικά φάρμακα, οδηγώντας σε υπερβολική παραγωγή φλεγμονωδών μορίων, υπερβολική φλεγμονή, και παρεμπόδισε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την αναδιαμόρφωση των ιστών. Η έρευνα έχει βρει ότι η Τβ4 μπορεί να μειώσει τα επίπεδα των ελεύθερων ριζών, επιβραδύνει την υπεροξείδωση των λιπιδίων, αναστέλλουν την παραγωγή φλεγμονωδών κυτοκινών όπως η IL-1, μακροφάγος φλεγμονώδης πρωτεΐνη 1α (MIP1α), ΜΙΡ1β, μονοκυτταρική χημειοτακτική πρωτεΐνη-1 (MCP-1), μείωση των επιπέδων θρομβοξάνης και προσταγλανδίνης 2α, ανακουφίζοντας έτσι τη φλεγμονή. Επομένως, μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία φλεγμονωδών διαταραχών όπως η τμηματική εντερίτιδα και η μυϊκή ατροφία.
Διέγερση διαφοροποίησης βλαστικών κυττάρων επικαρδίου ενηλίκου: Η Τβ4 παίζει καθοριστικό ρόλο σε διάφορες πτυχές της ανάπτυξης των στεφανιαίων αγγείων και μπορεί να διεγείρει σημαντικά την ανάπτυξη επικαρδιακών μοσχευμάτων σε ηρεμία ενήλικου ποντικού, αποκαθιστώντας την πολυδύναμη των ινοβλαστών, λεία μυϊκά κύτταρα, και ενδοθηλιακά κύτταρα, και προκαλώντας τη διαφοροποίησή τους.[1][2] Το νοκ-άουτ του γονιδίου Τβ4 στην καρδιά οδηγεί σε σημαντική μείωση των επιπέδων του αγγειογόνου προϊόντος διάσπασης του Τβ4 (AcSDKP). Αν και η ένεση AcSDKP δεν μπορεί να αποκαταστήσει την καρδιά, μπορεί να ενισχύσει σημαντικά τη διαφοροποίηση των επικαρδιακών προγονικών κυττάρων ενηλίκου ποντικού σε ενδοθηλιακά κύτταρα. Αυτό υποδηλώνει ότι το Tβ4 και το AcSDKP είναι ισχυροί διεγέρτες στεφανιαίας και νεοαγγείωσης, και επικαρδιακά κύτταρα ενηλίκων ποντικού που προκαλούνται από Τβ4 μπορούν να χρησιμεύσουν ως πηγή αγγειακής αναγέννησης, που οδηγεί σε παρατεταμένη αναγέννηση του κατεστραμμένου αγγείου σε χαμηλό επίπεδο μετά από καρδιακή βλάβη.
Διέγερση της ανάπτυξης των τριχοθυλακίων: Η Τβ4 προάγει τη μετανάστευση, διάκριση, και εξωκυτταρική αναδόμηση βλαστικών κυττάρων τριχοθυλακίου, ρυθμίζοντας έτσι την ανάπτυξη των μαλλιών. Μελέτες σε αρουραίους και ποντίκια έχουν δείξει ότι κατά τη διάρκεια του κύκλου ανάπτυξης της τρίχας, ένα συγκεκριμένο υποσύνολο κερατινοκυττάρων του θύλακα της τρίχας που προέρχονται από την περιοχή της διόγκωσης συνεκφράζουν σε μεγάλο βαθμό την Τβ4, ενώ τα βλαστοκύτταρα του δέρματος υπάρχουν και στο εξόγκωμα του τριχοθυλακίου. Όταν η συγκέντρωση Τβ4 είναι σε νανομοριακό επίπεδο, η μετανάστευση και η διαφοροποίηση των βλαστοκυττάρων ενισχύονται, και η παρουσία του Τβ4 αυξάνει επίσης την έκφραση και την έκκριση της μεταλλοπρωτεϊνάσης μήτρας-2 (MMP-2), ένα ένζυμο αποικοδόμησης της εξωκυτταρικής μήτρας.
Σχέση με σχηματισμό όγκου: Ανοδική ρύθμιση του γονιδίου Τβ4 έχει παρατηρηθεί σε διάφορα καρκινικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένου του μυελικού καρκινώματος του θυρεοειδούς, καρκίνο του παχέος εντέρου, εξαιρετικά κακοήθη μελάνωμα, καρκίνο του μαστού, και ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα του στόματος. Η Τβ4 μπορεί να επάγει αποτελεσματικά την έκφραση του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα, προάγοντας την αγγειογένεση και ενεργοποιώντας τις μεταναστευτικές ιδιότητες των κυττάρων, που οδηγεί σε κακοήθεια όγκου. Η ανοδική ρύθμιση της έκφρασης Τβ4 οδηγεί σε μείωση της έκφρασης της Ε-καντερίνης, αποδυνάμωση της κυτταρικής προσκόλλησης, και αυξημένη έκφραση μεταλλοπρωτεϊνασών μήτρας, παρέχοντας πλεονέκτημα ανάπτυξης και διεισδυτικά χαρακτηριστικά στα καρκινικά κύτταρα, συμβάλλοντας έτσι στην κακοήθεια. Το Τβ4 έχει αντι-αποπτωτικές ικανότητες, και η αυξημένη έκφραση του Τβ4 μπορεί να μειώσει την έκταση της κυτταρικής απόπτωσης, πιθανώς λόγω του ότι η Τβ4 αναστέλλει την απελευθέρωση του κυτοχρώματος c και διαταράσσει την έναρξη της διαδικασίας απόπτωσης, που είναι ένα άλλο σημαντικό χαρακτηριστικό των κακοήθων όγκων.
Προώθηση της αποκατάστασης του κερατοειδούς: Η θυμοσίνη β4 έχει αποδείξει την ικανότητά της να προάγει την επούλωση πληγών σε διάφορα μοντέλα τραυματισμού του κερατοειδούς και να ρυθμίζει την παραγωγή ορισμένων βασικών κυτοκινών. Έρευνες έχουν βρει ότι η θυμοσίνη β4 μπορεί να μειώσει την έκφραση των μεταλλοπρωτεϊνασών μήτρας, προωθούν την αναδιαμόρφωση της εξωκυτταρικής μήτρας, και ενεργοποιούν τις κυτοκίνες. Ειδικά, αναστέλλει τη δραστηριότητα των μεταλλοπρωτεϊνασών μήτρας, αντίθετα με το συμπέρασμα που συνάγεται από μοντέλα δερματικών τραυματισμών που έλαβαν θεραπεία με θυμοσίνη β4. [1][2][3]Αυτό υποδηλώνει ότι οι ρυθμιστικές οδοί συγκεκριμένων ενζύμων στη διαδικασία επιδιόρθωσης των ιστών μπορούν είτε να ρυθμιστούν προς τα πάνω είτε να μειωθούν.
Μέθοδος Παρασκευής
Τη στιγμή, υπάρχουν δύο κύριες πηγές θυμοσίνης βήτα 4 (Tβ4) χρησιμοποιείται σε κλινικά και ερευνητικά περιβάλλοντα: εκχύλιση από θύμο βοοειδών και χημική σύνθεση. Η εξαγωγή της Τβ4 από τον θύμο βοοειδών δεν είναι μόνο δαπανηρή αλλά επίσης περιορίζεται από τη διαθεσιμότητα υλικού και τις τεχνικές εκχύλισης, με αποτέλεσμα χαμηλή καθαρότητα και χαμηλή περιεκτικότητα. Η παρουσία ακαθαρσιών φέρνει επίσης πολλά προβλήματα, ιδίως λαμβάνοντας υπόψη τον αυξανόμενο αριθμό ιών στα βοοειδή, γεγονός που περιπλέκει τη διαδικασία εξαγωγής. Με την ανάπτυξη της γενετικής μηχανικής, Η χρήση μεθόδων γενετικής μηχανικής για την παραγωγή Τβ4 θα γίνει μια νέα κατεύθυνση. Στο εργαστήριό μας, σχεδιάζουμε να πραγματοποιήσουμε διαδοχική έκφραση τεχνητά συντιθέμενης Τβ4 σε φυτά για να λάβουμε διαγονιδιακά φυτά με αποτελεσματική έκφραση της Τβ4. Σε σύγκριση με φυσικά εκχυλισμένα Τβ4, Η Τβ4 που παράγεται με χρήση διαγονιδιακών φυτών έχει τα πλεονεκτήματα της υψηλότερης βιοδραστικότητας, υψηλότερη καθαρότητα, και λιγότερες παρενέργειες. Επιπλέον, αντιπροσωπεύει τη βέλτιστη προσέγγιση για τη μείωση του κόστους παραγωγής, ελαχιστοποίηση της μόλυνσης, και επιτρέπει την παραγωγή μεγάλης κλίμακας.[3]
Φόντο
Thymosin beta 4 είναι ένα πεπτίδιο που αποτελείται από 43 υπολείμματα αμινοξέων με ισοηλεκτρικό σημείο του 5.1 και είναι εξαιρετικά συντηρημένο στα θηλαστικά. Είναι μια κυτταροπλασματική πρωτεΐνη και όχι μια πυρηνική πρωτεΐνη, σε αντίθεση με τη θυμοσίνη άλφα ή παρόμοιες θυμοσίνες. [2][3]Thymosin beta 4 εμπλέκεται σε διάφορες φυσιολογικές λειτουργίες, συμπεριλαμβανομένης της ανοσοποιητικής λειτουργίας, ανάπτυξη του νευρικού συστήματος, επούλωση πληγών, και πρωτεϊνικές λειτουργίες ακτίνης.
Σε αντίθεση με τη θυμοσίνη άλφα ή παρόμοιες θυμοσίνες, thymosin beta 4 είναι μια κυτταροπλασματική πρωτεΐνη και όχι μια πυρηνική πρωτεΐνη. Περιέχει λιγότερα υδρόφοβα αμινοξέα και δεν περιέχει τη δομική περιοχή Lys-Lys-Xaa-Lys. Μελέτες χημικής διαμόρφωσης έχουν δείξει ότι η θυμοσίνη βήτα 4 υπάρχει και λειτουργεί ως ενιαία αλυσίδα. Έχει μια εσωτερική περιοχή επανάληψης μεταξύ των υπολειμμάτων 31-43 και 18-30, με έξι πανομοιότυπα αμινοξέα. Αν και υπάρχουν δύο εξαιρετικά ελικοειδείς περιοχές μεταξύ των υπολειμμάτων 4-12 και 32-40, thymosin beta 4 δεν σχηματίζει στροφή προλίνης. Ως προς τη βιολογική κατανομή και έκφραση, thymosin beta 4 καθαρίστηκε αρχικά από τον θύμο αδένα. Επομένως, Αρχικά πιστευόταν ότι ήταν μια θυμική ορμόνη που δρα στην ωρίμανση των Τ-κυττάρων πρώιμου σταδίου. Ωστόσο, thymosin beta 4 υπάρχει ευρέως σε άλλους ιστούς, όργανα, και κύτταρα, με τα υψηλότερα επίπεδα να βρίσκονται στον σπλήνα, θύμος, πνεύμονες, και περιτοναϊκών μακροφάγων, ακολουθούμενο από τον εγκέφαλο, συκώτι, νεφρά, όρχεις, και καρδιά. Ακόμη και κύτταρα μη δικτυοενδοθηλιακού συστήματος, όπως οι ινοβλάστες, μπορούν να συνθέσουν τη βήτα θυμοσίνη 4. Τα θυμοκύτταρα έχουν επτά φορές υψηλότερα επίπεδα θυμοσίνης βήτα 4 mRNA από τα στρωματικά κύτταρα του θύμου, και θυμοσίνη βήτα 4 η έκφραση παρατηρείται σε διάφορους τύπους αιμοσφαιρίων. Μελέτες για τη θυμοσίνη βήτα 4 Το cDNA έχει δείξει ότι στερείται πεπτιδίου σήματος.[1] Αν και υπάρχουν επίσης εκκρινόμενες πρωτεΐνες στον οργανισμό που στερούνται πεπτιδίων σήματος, όπως η ιντερλευκίνη-1 (IL-1) και ενδοθηλιακών αυξητικών παραγόντων, οι ειδικοί εξακολουθούν να πιστεύουν ότι η θυμοσίνη βήτα 4 είναι απίθανο να είναι μια εκκρινόμενη πρωτεΐνη και είναι πιο πιθανό να είναι απαραίτητη για ορισμένες βασικές κυτταρικές λειτουργίες.
Εφαρμογή
Βασική και εφαρμοσμένη έρευνα για τη βελτιστοποίηση της λειτουργίας των ενδοθηλιακών προγονικών κυττάρων με θυμοσίνη βήτα 4 (Tβ4)
Η επίπτωση και τα ποσοστά θνησιμότητας των ισχαιμικών καρδιαγγειακών νοσημάτων αυξάνονται χρόνο με το χρόνο, αποτελούν σοβαρή απειλή για την ανθρώπινη υγεία. Η παθογένεση αυτών των ασθενειών είναι εξαιρετικά περίπλοκη, και η δυσλειτουργία των ενδοθηλιακών κυττάρων παίζει κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη ισχαιμικών καρδιαγγειακών παθήσεων. Αν και τα ώριμα ενδοθηλιακά κύτταρα μπορούν να επιδιορθώσουν την ενδοθηλιακή βλάβη, η αναγεννητική τους ικανότητα είναι περιορισμένη. Ενδοθηλιακά προγονικά κύτταρα (EPC) είναι ένας τύπος πρόδρομων κυττάρων για αγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα και έχουν τη δυνατότητα να διαφοροποιούνται σε ενδοθηλιακά κύτταρα. Πολυάριθμες μελέτες έχουν δείξει ότι τα EPC παίζουν διάφορους ρόλους στην αγγειακή αποκατάσταση και νεοαγγείωση. Ωστόσο, η κλινική εφαρμογή της μεταμόσχευσης EPC εξακολουθεί να αντιμετωπίζει πολλές προκλήσεις. Αρκετές καρδιαγγειακές παθήσεις ή παράγοντες κινδύνου όπως η γήρανση, υπέρταση, υπερχοληστερολαιμία, και ο διαβήτης μπορεί να μειώσει τον αριθμό των κυκλοφορούντων EPC και να βλάψει τη λειτουργία τους, περιορίζοντας σημαντικά την εφαρμογή τους σε ισχαιμικά καρδιαγγειακά νοσήματα. Επομένως, Η βελτίωση της λειτουργίας των EPC θα είναι μια σημαντική στρατηγική για τη μελλοντική θεραπεία μεταμόσχευσης EPC.[1][2]
Thymosin beta 4 (Tβ4), μια πρωτεΐνη χαμηλού μοριακού βάρους που αποτελείται από 43 υπολείμματα αμινοξέων, εμπλέκεται στη μεσολάβηση διαφόρων βιολογικών αποκρίσεων όπως η αγγειογένεση, επούλωση πληγών, και έλεγχος της φλεγμονής. Η προηγούμενη έρευνά μας έχει βρει ότι η Τβ4 μπορεί να ενισχύσει τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των EPC του ανθρώπινου περιφερικού αίματος ενώ αναστέλλει την απόπτωση και τη γήρανση τους. Η Τβ4 αυξάνει σημαντικά την αγγειογενετική ικανότητα των EPC, που δείχνει μια δοσοεξαρτώμενη σχέση με μέγιστο αποτέλεσμα στις 1000 του/mL (σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, 33.33±1,86 έναντι 18,34±2,02, Π<0.05). Η ανάλυση Western blot δείχνει ότι το Τβ4 προάγει τη φωσφορυλίωση του Akt Ser473 και του eNOS Ser1177, επιδεικνύοντας επίσης μια δοσοεξαρτώμενη σχέση. Το Akt siRNA και το eNOS siRNA αναστέλλουν σημαντικά τις προ-αγγειογενετικές επιδράσεις του Tβ4 στα EPCs.
- Θεραπεία τραυμάτων του δέρματος
- Θεραπεία καρδιαγγειακών και εγκεφαλοαγγειακών κακώσεων
- Θεραπεία οφθαλμικών κακώσεων
- Άλλες εφαρμογές
Λόγω των βιολογικών του λειτουργιών, συμπεριλαμβανομένης της προώθησης της μετανάστευσης ενδοθηλιακών κυττάρων, πρόληψη της κυτταρικής απόπτωσης, αντιφλεγμονώδη αποτελέσματα, και προωθεί την ανάπτυξη των τριχοθυλακίων, Το Τβ4 δείχνει επίσης σημαντικές δυνατότητες στην περιποίηση του δέρματος, καταπολέμηση της γήρανσης του δέρματος, και την προώθηση της αναγέννησης των μαλλιών, μεταξύ άλλων πτυχών της υγειονομικής περίθαλψης.
