Abin da Reagent-Lalacewa A Haƙiƙa Ya Yi
Kafin auna QC, yana taimaka wa raba reagents azuzuwan da hannu. Jagororin bincike-bincike na ƙayyadaddun ƙwayoyin cuta da sinadarai sun bambanta masu ba da rahoto, bincike na tushen ayyuka, da reagents masu haɓaka alaƙa, kowane mai juya ubiquitin-proteasome tsarin (UPS) aiki a cikin ma'aunin karantawa a cikin sel, lysates, ko halayen da ba su da tantanin halitta.
-
Alamun mai walƙiya bari ku hango ko ƙididdige enzymes masu aiki, proteasome subunits, ko mai ba da rahoto ta hanyar in-gel fluorescence, microscope, ko samun / hasarar-sigina rahotanni.
-
Biotin labels kayan aikin haɓaka ne, kama aiki deubiquitinases (DUBs) ko gyare-gyaren sunadaran ta hanyar streptavidin da zazzage ƙasa kafin immunoblotting ko ganewar taro-spectrometry..
-
Ubiquitin da NEDD8-mimetic bincike da fluorogenic ko FRET substrates suna yin tambayoyi game da enzymes da ligases waɗanda dole ne su bambanta ubiquitin daga masu gyara masu kama da ubiquitin - ilmin sunadarai wanda ke yanke shawarar ko abin da ya faru na lalata da gaske ya faru..
-
Abubuwan lalata Ɗauki jerin ɓarna ko ɓarna ta yadda asarar da ta dogara da sinadarai ko proteasome ta haifar da canjin sigina mai ƙididdigewa..
Kowane ɗayan waɗannan matsayin yana ciniki akan ɗan ƙaramin tsari: wanda ragowar aka lakafta, inda gyara ya zauna, ko haɗin isopeptide ko oxyester daidai ne, da kuma ko shugaban yaki yana nan a daidai lokacin da ya dace. Reagent wanda "95% tsarki" ya ɓoye babban abin ƙyama ko share isomer na iya canza ɗaurin, kwanciyar hankali, ko ƙimar ƙasƙanci da ke bayyana isa don sake fasalin fassarar gabaɗayan allo.
Labeled Peptides Bukatar Tabbacin Takamaiman Takaddar
Alamar kyalli ko alamar biotin ba ƙari ba ne. Haɗin kai yana canza duka lokacin riƙewa da ionization a cikin chromatography, kuma yana gabatar da canjin taro mai iya tsinkaya - amma kawai idan nau'in da aka yi niyya shine abin da ya samo asali.
Ingancin reagent anan yana nufin tabbatar da mai lakabi nau'in, ba kawai peptide iyaye ba. Wannan yawanci yana buƙata:
-
Peptide Synthesis Tabbacin taro-spectrometry na alamar da aka ƙara ta hanyar canjin taro da ake tsammanin;
-
LC-MS ko UPLC suna bincika don tabbatar da alamar ƙwayoyin ƙwayoyin cuta da ionizes kamar yadda aka bayyana., rinjaye nau'in;
-
raba rahoton ainihi don lakabin, saboda canjin halayensa na iya rufe samfuran gefen haɗin gwiwa.
Don biotin, damuwa shine wadatar amana: wani yanki mai lakabi ko mis-biotinylated lot na iya ɗaure streptavidin daban kuma ya rushe tsarin sunadarai.. Don fluorophores, Yanayin gazawar ya bambanta amma daidai yake da rushewa - ƙazantar da ke haifar da autofluoresces a tsayin tsayin daka na sigina na gaske kuma yana haɓaka ƙimar ƙima.. Dakunan gwaje-gwaje na nunawa suna ƙara tambayar masu siyarwa don ba da rahoton ainihin taro mai lakabi da chromatogram na haɗin gwiwa na ƙarshe., ba kawai jerin tsarki ba.
Dole ne a Tabbatar da Takamaiman gyare-gyare na Assay, Ba a ɗauka ba
Rage reagents akai-akai ba bayyanannun peptides ba ne. Suna ɗaukar abubuwan ubiquitin-mimetic ko NEDD8-mimetic abubuwa, electrophilic warheads, kusanci iyawa, masu haɗin gwiwa, da FRET ko nau'i-nau'i na fluorogenic. Matsakaicin ra'ayi yana kan tabbatar da cewa nufi tsarin ya mamaye kuri'a kuma cewa babu isomer mara niyya, tsinkewa, ko samfurin gefe ya tara zuwa matakin da ke damun kima.
Don ƙananan ƙwayoyin ƙwayoyin cuta na masu lalata, aikin nazari ya riga ya fito fili: fakiti mai ƙarfi yana amfani da LC-MS ko HPLC don tsaftar kwayoyin halitta, NMR ko qNMR don tsari da ma'aunin taro, kuma sau da yawa binciken chiral ko karfe don kama stereocenter epimerization da gurɓataccen ƙarfe-ƙarfe wanda zai iya kashe haɗin gwiwar zinc.. The peptide da furotin reagents ciyar da fuska iri daya cancanci horo iri ɗaya - tabbatar da wurin gyarawa, tabbatar da haɗin gwiwa da ƙarewa, da fayyace kan ko mafi girman ƙazanta na iya tsoma baki tare da karatun nazarin halittu.
Jeri Amintaccen Ba a Tattaunawa
Ana yin odar dakunan karatu da na'urorin bincike yawanci akan ƙayyadadden tsari na farko wanda ke ƙunshe da ƙayyadaddun bayanai, a gane motif, wurin yanke enzyme, ko siginar dogaro da phosphorylation. Amincewar jeri yana nufin tsarin shine ainihin abin da aka aika - ba tare da gogewa ba, babu canji, babu rashin gaskiya, da kuma n- da C-termini.
Aminci shine inda gajerun hanyoyin bincike-mafi yawan fitowa fili. Dillali wanda ya tabbatar da cikakken taro shi kaɗai na iya rasa isomer mai gogewa mai nau'in ƙira ɗaya., ko shafin phospho da aka sanya akan ragowar da ba daidai ba. Amincewar matakin-jeri yana buƙatar taswirar peptide ko rarrabuwar MS/MS, nazarin amino-acid don abun da ke ciki, da - don gyare-gyaren gine-gine - tabbatar da cewa kowane rukunin da aka shigar yana zaune a wurin da aka nufa. Lokacin da gazawar allo mai lalacewa ko sakamakon DUB mai daure kai ya koma zuwa “layin da ya rage ya yi kuskure.,” farashin makonni ne na bayanan da ba za a iya yin su ba wanda babu software na ƙasa da zai iya gyarawa.
Tabbatar da Nazari na Orthogonal Yana Haɓaka Amincewa
Sigina na nazari ɗaya da wuya ya daidaita ainihi. Jagorar Hukumar Magunguna ta Turai akan ci gaba Peptides na roba da kuma ƙera peptides na roba yana ba da shawarar aƙalla hanyoyi biyu na orthogonal don ganewa, da kuma orthogonal size-, caji -, da kuma hanyoyin da suka danganci hydrophobicity don halayen tsabta.
Tabbatar da Orthogonal yana da mahimmanci don masu lakabi da gyare-gyaren reagents fiye da peptides madaidaiciya., saboda babu wata hanyar chromatographic da ke warware kowane iyali na ƙazanta. Masanin sinadarai da ke duba ƙayyadaddun ginin tantancewa zai yawanci haɗa HPLC mai juzu'i tare da sinadarai na shafi na biyu., Haɗa tabbacin taro tare da MS/MS ko taswirar peptide, kuma ƙara hanyoyin da aka yi niyya kamar rabuwar chiral don amincin stereochemical ko keɓancewar girman tare da watsawar haske mai kusurwa da yawa don yanayin tarawa.. Lokacin da reagent yana ciyar da adadin karantawa, wannan sheda mai kaifi shine abin da zai baka damar amincewa da cewa ainihi da da'awar tsarki na gaske ne kuma ba za a iya sake su ba - ba kashi ɗaya na yanki ɗaya ba..
Laburaren Nuna Rayuwa ko Mutu akan Daidaituwar Batch
Ana gina ɗakunan karatu daga rijiyoyi da yawa, gwangwani dayawa, kuma - sai dai idan kun shirya gaba - yawancin samarwa da yawa. Canjin tsari-zuwa-tsari shine mai kashe shuru na allo masu tsayi, saboda ɓata a cikin ƙaramin ƙazanta ko canjin yatsan yatsa na chromatographic yana canza halayen kima koda lokacin da kowane tsari ya wuce ƙayyadaddun tsaftarsa..
Tsarin daidaito yana da abubuwa uku:
-
Yawan ganowa - kowane vial ko farantin ɗakin karatu yana da alaƙa da ainihin mai gano ma'aunin tsari da takamaiman takaddun shaida na bincike., don haka duk wani sakamako ana iya gano shi zuwa kayan da ya samar da shi.
-
Kwatancen sawun yatsa - Sabbin kuri'a ana kwatanta su da ɗimbin kuri'a na baya da ƙa'idodin tunani ta lokacin riƙewa, taro, da rashin tsarki profile, ba kawai ta hanyar wucewa/ gazawa lambar tsarki ba.
-
Danyen bayanan da aka tattara - shaidar haƙiƙa (chromatograms, taro bakan) an tanadar da kowane tsari maimakon kaso na taƙaitaccen bayani, don haka dakunan gwaje-gwaje na iya tantance daidaito da kansu. Samuwar Peptide
Doka mai amfani don babban ɓarna ko ɗakin karatu shine samo asali daga abokin tarayya wanda ke ɗaukar sawun yatsa a matsayin na yau da kullun kuma yana iya nuna yadda adadin da aka bayar ya kwatanta da wanda ya inganta abubuwan da kuka samu a baya..
Matsayin Nuna Rarraba Protein: Abin da "Mai kyau ya isa" Yayi kama lokacin da kuka samo asali
Kuna iya fassara duk waɗannan zuwa gajeriyar saiti na tsammanin lokacin da kuka ƙididdige reagent ko kimanta mai kaya. A aikace, dakunan gwaje-gwajen da ke gudanar da ayyukan lalata suna neman abokan haɗin gwiwa waɗanda za su tattauna QC a bayan abin da aka bayar al'ada peptide kira oda maimakon a ba da adadi mai tsarki guda ɗaya.
Abubuwan da ake bukata sune: ainihi da aka tabbatar da fiye da m taro; lakabin da kowane gyare-gyare da aka tabbatar akan haɗin gwiwa na ƙarshe; Amintattun jerin da aka rubuta tare da amino-acid ko nazarin matakin-taswira inda ake buƙata; Hanyoyi na nazari na orthogonal bayan da'awar tsarkakewa da sifa; a gwajin peptide rikodin wanda ya haɗa da ɗanyen chromatograms da kuma yawan bakan da yawa; da daidaiton sawun yatsa a cikin ɗakin karatu.
Kyakkyawan dandamalin haɗin gwiwa zai kawo rarrabuwar kawuna mai daraja, Tabbatar da matakin MS/MS, endotoxin da bioburden iyaka, da takaddun matakin kuri'a zuwa teburin - saboda wannan shine bambanci tsakanin reagent wanda ke samar da allo mai tsabta da kuma wanda ke kera abubuwan karya a cikin rijiyoyi dari cikin nutsuwa..
Key Takeaway: A cikin gwajin lalata-protein, ingancin reagent shine ingantaccen inganci. Tabbatar da nau'ikan da aka yiwa lakabi akan jerin iyaye, tabbatar da kowane wurin gyarawa, amfani da hanyoyin nazari na orthogonal, da aiwatar da daidaiton sawun yatsa - saboda karatun zai yi la'akari da duk wanda aka tsallake daga cikin waɗannan..
Matakai na gaba
Fara da rubuta azuzuwan reagent allonku ya dogara da gaske - mai ba da rahoto, bincike, ko substrate - da kuma bayanan nazarin kowane ɗayan yana buƙata. Yi amfani da shi azaman tushe lokacin da kuka samo asali, kuma ka nemi masu ba da kaya su bi ka ta hanyoyin ka'ida da kuma shaidar yatsa mai yawa-zuwa-yawa a bayan kayan da kake shirin gudanarwa. 'Yan mintoci kaɗan da aka kashe don bitar QC a gaba na iya ceton ku daga sakamakon da ba za a iya sake fitowa ba wanda ke ɗaukar makonni don warwarewa..
