Ни өсөн аҡһым-деградация скринингы яҡшыраҡ пептид кәрәк & Аҡһым реагенттары

Ниндәй деградация-скрининг реагенты ысынында эшләргә тейеш

КК баһалар алдынан, ул ҡатнашҡан реагент кластарын айырырға ярҙам итә. Стандарт протеомик һәм химик-зонд етәкселәре флуоресцент репортерҙарҙы айыра, әүҙемлеккә нигеҙләнгән зондтар, һәм яҡынлыҡ-байытыусы реагенттар, һәр үҙгәртеп ҡороу убиквитин-протеасома системаһы (ИБП) әүҙемлеге күҙәнәктәрҙә үлсәүле уҡыуға әйләнә, лизаттар, йәки күҙәнәкһеҙ реакциялар.

• Флуоресцент этикеткалар Һеҙгә әүҙем ферменттарҙы күҙ алдына килтерергә йәки һанлаштырырға мөмкинлек бирә, протеасома субберәмектәре, йәки репортер субстраттар гель эсендәге флуоресценция ярҙамында, микроскопия, йәки өҫтөнлөк/юғалтыу-сигнал хәбәрселәре.

  

• Биотин ярлыҡтары байытыу ҡоралдары булып тора, әүҙем деубиквитиназаларҙы тотоу (ДУБ) йәки иммуноблоттинг йәки масс-спектрометрия идентификацияһы алдынан стрептавидин тартыу юлы менән үҙгәртелгән аҡһымдар.

• Убиквитин һәм NEDD8-миметик зондтар һәм фторген йәки FRET субстраттары ферменттарҙы һәм лигазаларҙы һорау ала, улар убиквитинды убиквитинға оҡшаш модификаторҙарҙан айырырға тейеш — химия, ысынлап та маҡсатлы деградация ваҡиғаһы булғанын хәл итә ..

  

• Деградация субстраттары йөрөтә дестабилизация йәки дегрон эҙмә-эҙлеклелек, шулай итеп, берләшмә-двигателдәр йәки протеасома-зависимый юғалтыу етештереү һанлы сигнал үҙгәрештәре.

Был ролдәрҙең һәр береһе бәләкәй генә структур деталдәр менән сауҙа итә .: ниндәй ҡалдыҡ тамғаланған, Ҡайҙа модификация ултыра, изопептид йәки оксиэфир бәйләнеше дөрөҫмө, һәм боеголовканың уң осонда бармы-юҡмы. Реагент, уның “95% таҙалығы” йәшерә доминант де-амидированный йәки делеция изомер үҙгәртә ала бәйләү ., тотороҡлолоҡ, йәки күренеп торған деградация тиҙлеге етерлек үҙгәртеп ҡороу өсөн интерпретация тотош экран ..

Маркировкаланған пептидтарға махсус раҫлау кәрәк

Флуоресцент йәки биотин биркаһы пассив өҫтәмә түгел .. Конъюгация хроматографияла һаҡлау ваҡытын да, ионлашыуҙы ла үҙгәртә, һәм ул күҙаллаусан масса күсеүен индерә — әммә тик әгәр ҙә тәғәйенләнгән төрҙәре нимә барлыҡҡа килгән.

Реагент сифаты бында раҫлау тигәнде аңлата ярлыҡланған төр, ата-әсә пептиды ғына түгел. Был, ғәҙәттә, талап итә:

• Пептидтар синтезы масс-спектрометрия тикшереү өҫтәлгән ярлыҡ аша көтөлгән масса күсеүе;

• LC-MS йәки UPLC тикшерергә раҫлау өсөн маркировкаланған молекула элюирует һәм ионизировать бер билдәләнгән, доминант төрө;

• ярлыҡ өсөн айырым шәхес отчеты, сөнки уның үҙгәртелгән тәртибе битлек ала со-элюирующий ян продукттары.

Биотин өсөн, борсолоу - байытыу тоғролоҡ: өлөшләтә маркировкаланған йәки дөрөҫ булмаған биотинилланған лот стрептавидинды төрлөсә бәйләй һәм дөрөҫ булмаған аҡһымдар йыйылмаһын тартып төшөрә ала. Флюорофорҙар өсөн, етешһеҙлектәр режимы төрлө, әммә бер үк тарҡатыусы — бысраҡлыҡ, автофлуоресценция анализ тулҡын оҙонлоғонда ысын сигналды имитациялай һәм хит ставкаларын ҡабарта. Скрининг лабораториялары һатыусыларҙан теүәл маркировкаланған масса һәм һуңғы конъюгаттың хроматограммаһы тураһында хәбәр итеүҙе һорай., эҙмә-эҙлеклелек сафлығы ғына түгел.

Анализ-махсус үҙгәрештәр раҫланырға тейеш, Фаразланмаған

Деградация реагенттары йыш ҡына ябай пептидтар түгел. Улар убиквитин-миметик йәки NEDD8-миметик элементтарҙы йөрөтә, электрофил боеголовкалар, яҡынлыҡ тотҡаһы, линкерҙар, һәм ФРЭТ йәки фторген парҙар. Дәлилләү йөкләмәһе раҫлау өҫтөндә, тип ниәтләнгән структураһы өҫтөнлөк итә һәм был бер ниндәй ҙә уйламаған изомер, ҡыҫҡартыу, йәки ян продукт кимәлгә тиклем тупланған, тип боҙа анализ.

Деградаторҙарҙың бәләкәй молекулалы яғы өсөн, аналитик практика инде асыҡ: ныҡлы пакет органик таҙалыҡ өсөн ЖК-МС йәки ВЭЖХ ҡуллана, ЯМР йәки кЯМР структураһы һәм масса балансы өсөн, һәм йыш ҡына хираль йәки металл анализ тотоу өсөн стереоцентр эпимеризация һәм микрометалл бысратыусылар, цинк координацияһын һүндерә ала. Пептид һәм аҡһым реагенттар туҡландырыу бер үк экрандар лайыҡлы бер үк дисциплина — тикшерелгән модификация сайты ., бәйләнеш һәм терминдарҙы раҫлау, һәм асыҡлыҡ тураһында өҫтөнлөклө бысраҡлыҡ биологик уҡыу ҡамасаулай аламы.

Эҙмә-эҙлеклелек тоғролоғо тураһында һөйләшеүҙәр алып барылмай

Скрининг китапханалары һәм зондтар йыйылмалары, ғәҙәттә, билдәләнгән беренсел структураға ҡаршы тәртипкә килтерелә, улар дегронды кодлай., таныу мотивы, фермент ҡырҡылған урын, йәки фосфорилләшеүгә бәйле сигнал. Эҙмә-эҙлеклелек тоғролоҡ тигәнде аңлата, структураһы нимә ысынында ташылған — юйыу менән, алмаштырыу юҡ, дөрөҫ булмаған инкорпорация юҡ, һәм дөрөҫ N .- һәм С-терминалар.

Тоғролоҡ ҡайҙа тикшеренеүҙең ярлыҡтары йыш ҡына ер өҫтө. Һатыусы, тип раҫлай интакт масса яңғыҙ үткәрергә мөмкин юйыу изомер менән бер үк номиналь масса, йәки дөрөҫ булмаған ҡалдыҡҡа ҡуйылған фосфо-урын. Эҙмә-эҙлеклелек кимәлендә ышаныс талап итә пептид картаһы йәки MS/MS фрагментация, составы өсөн аминокислоталар анализы, һәм — ныҡ үҙгәртелгән конструкциялар өсөн — һәр ҡуйылған төркөмдөң тәғәйенләнгән урында ултырыуын раҫлау. Ҡасан уңышһыҙлыҡҡа осраған деградатор экран йәки аңлашылмаған DUB һөҙөмтәһе эҙҙәрен кире “субстрат эҙмә-эҙлеклелеге бер ҡалдыҡ дөрөҫ булмаған .,” хаҡы аҙна невоспроизводимый мәғлүмәттәр, бер ниндәй ҙә нижестоящий программа тәьминәте төҙәтә алмай ..

Ортогональ аналитик раҫлау ышаныс күтәрә

Бер аналитик сигнал һирәк осраҡта үҙенсәлекте хәл итә. Европа дарыуҙар агентлығы етәкселеге буйынса үҫеш Синтетик пептидтар һәм синтетик пептидтар етештереү идентификациялау өсөн кәмендә ике ортогональ ысул тәҡдим итә, һәм ортогональ ҙурлыҡ-, етәкселек-, һәм таҙалыҡты характерлау өсөн гидрофоблыҡҡа нигеҙләнгән алымдар.

Ортогональ раҫлау туранан-тура һыҙыҡлы пептидтарға ҡарағанда маркировкаланған һәм үҙгәртелгән реагенттар өсөн күберәк мөһим., сөнки бер хроматографик ысул да һәр бысраҡлыҡ ғаиләһен хәл итмәй. Ҡатмарлы скрининг конструкцияһын тикшергән химик, ғәҙәттә, икенсе колонкалы химия менән кире фазалы ВЭЖХ-ны парлаштырасаҡ, масса раҫлау менән берләштереү MS/MS йәки пептид картаһы, һәм өҫтәү маҡсатлы ысулдар, мәҫәлән, хираль айырыу өсөн стереохимик бөтөнлөк йәки ҙурлыҡ-сығарыу менән күп мөйөшлө яҡтылыҡ һибеү өсөн агрегация хәле .. Ҡасан реагент туҡландырыу миҡдар уҡыу, был ҡатламлы дәлилдәр нимә һеҙгә ышанырға мөмкинлек бирә, тип, үҙенсәлек һәм сафлыҡ дәғүәләре ысын һәм ҡабатлана — бер генә пик-майҙан проценты түгел ..

Скрининг китапханалары йәшәй йәки үлә пакет эҙмә-эҙлеклелеге буйынса

Күп скважиналарҙан скрининг китапханалары төҙөлә ., күп флакондар, һәм — әгәр һеҙ алдан планлаштырыу — күп етештереү лоттары .. Партия-партия үҙгәрмәй тороу тыныс үлтереүсе оҙонлоҡ экрандар, сөнки дрейф ваҡ бысраҡлыҡ йәки күсерелгән хроматографик бармаҡ эҙе анализ тәртибен үҙгәртә, хатта һәр партия номиналь үткәндә, уның таҙалыҡ спец.

Эҙмә-эҙлеклелек дисциплинаһы өс компоненттан тора .:

• Лот эҙләү мөмкинлеге — һәр флакон йәки китапхана пластинкаһы теүәл партия идентификаторы һәм партияға хас анализ сертификаты менән бәйләй, тимәк, теләһә ниндәй һөҙөмтәне уны етештергән материалға эҙләргә мөмкин.

• Бармаҡ эҙҙәрен сағыштырыу — яңы лоттар элекке лоттар һәм эталон стандарттар менән сағыштырыла, һаҡлау ваҡыты буйынса, күп кеше ҡатнашҡан, һәм бысраҡлыҡ профиле, үткән/үтмәгән таҙалыҡ һаны буйынса ғына түгел.

• Документлаштырылған сеймал мәғлүмәттәре — объектив дәлилдәр (хроматограммалар, масса спектрҙары) йыйнаҡ процент түгел, ә һәр партия менән тәьмин ителә, Шулай итеп, скрининг лабораториялары үҙҙәре өсөн эҙмә-эҙлеклелекте баһалай ала. Пептидтар етештереү

Ҙур деградатор йәки зонд китапханаһы өсөн практик ҡағиҙә булып тора, партнерҙан сығанаҡ, ул партиялы дактилоскопия ғәҙәти рәүештә ҡарай һәм күрһәтә ала, нисек бирелгән лот менән сағыштырғанда, һеҙҙең элекке хиттар раҫланған ..

Аҡһым-деградация скрининг дәрәжәһе: Нимә “Етерлек яҡшы” Ҡасан Һеҙ Сығанаҡ

Һеҙ был бөтә тәржемә итә ала, ҡыҫҡа йыйылма өмөттәр, ҡасан һеҙ spec реагент йәки баһалау тәьмин итеүсе .. Ғәмәлдә ., лабораториялар, улар эшләй деградация эш ағымы партнерҙары эҙләй, улар фекер алышырға QC артында бирелгән Ҡулланыусылар өсөн пептид синтезы заказ түгел, ә бер генә таҙалыҡ һанын тапшырыу.

Иң мөһиме -: үҙенсәлек бөтөн массанан күберәк менән раҫланған; ярлыҡ һәм һәр модификация тикшерелгән һуңғы конъюгат; эҙмә-эҙлеклелек тоғролоғо документлаштырылған аминокислота йәки карта кимәлендә анализ ҡайҙа кәрәк; таҙалыҡ һәм характеристика дәғүәләре артында ортогональ аналитик ысулдар; а пептид тикшереү яҙма, сеймал хроматограммалар һәм масса спектрҙары бер лотҡа инә; һәм партия-бармаҡ эҙҙәре эҙмә-эҙлеклелеге китапхана буйынса һаҡлана.

Абруйлы синтез платформаһы килтерәсәк тотоу-класс ортогональ айырыу, MS/MS-кимәлендә раҫлау, эндотоксин һәм биойөк сиктәре, һәм лот кимәлендә документация таблицаға — сөнки был айырма реагент, етештереү таҙа экран һәм бер, тыныс ҡына етештереү ялған ыңғай аша йөҙ скважина ..

Асҡыс алып барыу: Аҡһым-деградация скринингында, реагент сифаты - анализдың дөрөҫлөгө. Ата-әсә эҙмә-эҙлеге буйынса билдәләнгән төрҙәрҙе тикшерергә, һәр үҙгәртеү сайтын раҫлау, ортогональ аналитик алымдар ҡулланыу, һәм үтәү өсөн кросс-партия бармаҡ эҙҙәре эҙмә-эҙлеклелеге — сөнки уҡыу өнһөҙ сағылдырасаҡ, был ҡайһыһы үткәрелгән.

Киләһе аҙымдар

Башланғыс яҙып реагент кластары һеҙҙең экран ысынында бәйле — хәбәрсе ., зонд, йәки субстрат — һәм аналитик документация һәр береһе кәрәк. Ҡулланыу, тип, нигеҙ һыҙығы булараҡ, ҡасан һеҙ сығанаҡ, һәм тәьмин итеүселәрҙән һеҙҙең аша йөрөүен һорау ортогональ ысулдар һәм лот-лот бармаҡ эҙҙәре дәлилдәре артында материал һеҙ йүгерергә йыйынған .. Бер нисә минут үткәрелгән тикшергән QC алдан һеҙҙе ҡотҡара ала невоспроизводимый скрининг һөҙөмтәһе, был аҙналар кәрәк, тип ял итеү өсөн ..