Σχεδιασμός προτύπων πεπτιδίων για πολυπλεξικές ανοσοαναλύσεις Luminex: Ένα εργαστηριακό πρωτόκολλο
Συστοιχίες ανάρτησης πολλαπλών σφαιριδίων, όπως οι τεχνολογίες Luminex xMAP και MagPlex, βασιστείτε σε βαθμονομητές υψηλής χαρακτηριστικής απόδοσης για την παροχή ακριβών ποσοτικών δεδομένων σε πάνελ πολλαπλών αναλυτών. Ενώ οι ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες πλήρους μήκους χρησίμευαν ιστορικά ως τυπικοί βαθμονομητές, Τα συνθετικά πεπτίδια έχουν προκύψει ως το χρυσό πρότυπο για την ποσοτικοποίηση του συγκεκριμένου επίτοπου, επαλήθευση βιοδεικτών, και υψηλής απόδοσης προφίλ αντισωμάτων. Τα συνθετικά πεπτίδια προσφέρουν καθορισμένη στοιχειομετρία, ελάχιστη δομική διακύμανση από παρτίδα σε παρτίδα, και οικονομικά αποδοτική επεκτασιμότητα.
Ωστόσο, η μετάφραση μιας ακατέργαστης πεπτιδικής αλληλουχίας σε ένα επικυρωμένο πρότυπο ανοσοδοκιμασίας απαιτεί αυστηρό χημικό σχεδιασμό και βελτιστοποίηση βιοσύζευξης. Μικρά συνθετικά πεπτίδια (<30 αμινοξέα) συχνά παρουσιάζουν κάλυψη επιτόπου όταν ακινητοποιούνται απευθείας σε καρβοξυλιωμένες μικροσφαίρες, μη ειδική υδρόφοβη προσρόφηση, ή ανακριβής βαθμονόμηση βαρυμετρικής συγκέντρωσης που προκαλείται από παραμόρφωση μάζας αντίθετου ιόντος.
Αυτό το πρωτόκολλο έτοιμο για πάγκο περιγράφει μια μεθοδολογία 5 φάσεων για το σχεδιασμό, τροποποιώντας, σύζευξη, και επικύρωση πρότυπα πεπτιδίων για πολυπλέκτες ανοσοαναλύσεις Luminex, εξασφαλίζοντας τη μέγιστη προσβασιμότητα του επιτόπου, ελάχιστη διασταυρούμενη αντιδραστικότητα, και αυστηρή αναπαραγωγιμότητα της ανάλυσης. Διπεπτίδιο Χονδρική
Φάση 1: Επιλογή ακολουθίας και Αρχιτεκτονική Σύνδεσης
Η ακινητοποίηση βραχέων συνθετικών πεπτιδίων απευθείας σε επιφάνειες από πολυστυρένιο ή μαγνητικά σφαιρίδια συχνά οδηγεί σε στερεοχημικό εμπόδιο, όπου η μήτρα σφαιριδίων εμποδίζει την πρόσβαση αντισωμάτων στα υπολείμματα δέσμευσης κλειδιού. Ο βέλτιστος σχεδιασμός ακολουθίας εξισορροπεί τη φυσική σταθερότητα, διαμορφωτική ευελιξία, και παρουσίαση για συγκεκριμένο ιστότοπο.
1. Χαρτογράφηση επιτόπου και μήκος ακολουθίας
- Ελάχιστος προσδιορισμός επιτόπου: Προσδιορίστε βασικά γραμμικά ή συνεχή διαμορφωτικά μοτίβα σύνδεσης (τυπικά 8-15 αμινοξέα).
- Πλευρικά κατάλοιπα: Διατηρήστε 2–4 γηγενείς Ν- και C-τερματικά πλευρικά αμινοξέα για τη διατήρηση της τοπικής δευτεροταγούς δομής και της ιοντικής διαλυτότητας.
- Μετριασμός υδροφοβικότητας: Υπολογίστε τον μεγάλο μέσο όρο της υδροπάθειας (ΣΑΛΤΣΑ) σκορ. Αλληλουχίες με υψηλά υδροφοβικά υπολείμματα (Trp, Phe, Leu, Με) τείνουν να καταρρέουν πάνω στον υδρόφοβο πυρήνα σφαιριδίων πολυστυρενίου, που οδηγεί σε υψηλή μη ειδική δέσμευση (NSB). Συμπεριλάβετε ετικέτες διαλυτοποίησης (όπως προσθήκες Lys-Lys ή Glu-Glu σε άκρα χωρίς επίτοπο) αν χρειαστεί.
2. Spacers και Flexible Linkers
Να προβάλει τον επίτοπο πέρα από το υδροδυναμικό οριακό στρώμα σφαιριδίων, εισάγετε ένα υδρόφιλο διαχωριστικό μεταξύ της λειτουργικής λαβής ζεύξης και της αλληλουχίας στόχου.
- Αποστάτες PEG: Συνδετήρες πολυαιθυλενογλυκόλης (PEG2, PEG4, ή PEG12) παρέχουν ανώτερη υδατική διαλυτότητα και μηδενική ανοσογονικότητα σε σύγκριση με τις άκαμπτες αλυσίδες υδρογονάνθρακα.
- Αμινο-εξανοϊκό οξύ (Αααα): Κατάλληλο για μέτρια υδρόφιλες ακολουθίες που απαιτούν φυσική μετατόπιση 1–2 nm.
Για Συμβουλή: Τοποθετείτε πάντα τον εύκαμπτο διαχωριστή PEG μεταξύ της θέσης αντιδραστικής ζεύξης (π.χ., Ν-τελική αμίνη ή τερματική Cys) και τον επίτοπο. Η απευθείας σύζευξη χωρίς διαχωριστικό μπορεί να μειώσει τη συγγένεια δέσμευσης αντισωμάτων κατά 40-70% λόγω της στερεοχημικής θωράκισης από την επιφάνεια καρβοξυλίου σφαιριδίων.
Φάση 2: Χημεία Τροποποίησης και Επισήμανσης Ειδικής τοποθεσίας
Η τυχαία ή μη κατευθυντική σύζευξη μεταβάλλει τη διαμόρφωση του επιτόπου και προκαλεί μεταβλητότητα προσανατολισμού από παρτίδα σε παρτίδα. Η χημική τροποποίηση για την τοποθεσία εξασφαλίζει ομοιόμορφη χωρική παρουσίαση σε κάθε περιοχή μικροσφαιρών.
| Επιλογές Ακινητοποίησης Προσανατολισμού | Λεπτομέρεια |
|---|---|
| Επιλογή Α | N-Terminus / Lys Amine PEG4 Spacer → EDC/S-NHS Amide Bond → COOH-MagPlex Bead |
| Επιλογή Β | Τερματική ετικέτα βιοτίνης PEG4 Spacer → σύλληψη στρεπταβιδίνης → Avidin-MagPlex Bead |
| Επιλογή Γ | Τερματική λαβή θειόλης κυστεΐνης μαλεϊμίδης → Σύνδεση θειοαιθέρα → χάντρα αμίνης-MagPlex |
1. Βιοτινυλίωση vs. Άμεση σύζευξη αμίνης
- Τερματική βιοτινυλίωση: Ενσωμάτωση Ν-τερματικής Βιοτίνης ή Lys(Βιοτίνη) μέσω ενός συνδετήρα PEG4 επιτρέπει γρήγορη, ακινητοποίηση υψηλής συγγένειας σε μικροσφαιρίδια MagPlex επικαλυμμένα με στρεπταβιδίνη (K d ≈ 10^{-14} Μ). Αυτό εξαλείφει την ανάγκη για χημεία καρβοδιιμιδίου στο σφαιρίδιο κατά τη ρύθμιση της ανάλυσης.
- Άμεση σύζευξη αμίνης: Εάν χρησιμοποιείτε καρβοξυλιωμένο (COOH) Μικροσφαίρες MagPlex, βεβαιωθείτε ότι το πεπτίδιο περιέχει μόνο ένας πρωτοταγής αμίνη (το Ν-άκρο). Τα εσωτερικά υπολείμματα λυσίνης εντός του επιτόπου πρέπει να υποκαθίστανται ή να προστατεύονται κατά τη σύνθεση για να αποτραπεί η ετερογενής σύνδεση πολλών σημείων που διαταράσσει την αναγνώριση αντισωμάτων.
2. Fluorescent Tagging για έλεγχο ποιότητας Multiplex
Κατά την επικύρωση καναλιών αναφοράς ή την παρακολούθηση της πυκνότητας φόρτωσης σφαιριδίων, ορθογώνια φθοροφόρα (π.χ., Alexa Fluor 488 ή FITC) μπορεί να συζευχθεί με μη ανταγωνιστικές τερματικές πλευρικές αλυσίδες Λυσίνης.
- Φασματική συμβατότητα: Βεβαιωθείτε ότι τα φάσματα διέγερσης/εκπομπής ετικετών δεν επικαλύπτονται με τα εσωτερικά λέιζερ ταξινόμησης Luminex (κόκκινες/υπέρυθρες βαφές στο 658 nm και 712 nm, ή πράσινα κανάλια ρεπόρτερ στο 525 nm σε συστήματα Intelliflex).
Φάση 3: Πρωτόκολλο Luminex MagPlex Bead Coupling
Καρβοξυλιωμένες μικροσφαίρες xMAP (MagPlex COOH) περιέχουν επιφανειακές καρβοξυλικές ομάδες (~107 COOH/σφαιρίδιο) που αντιδρούν με πρωτοταγείς αμίνες μέσω χημείας καρβοδιιμιδίου δύο σταδίων χρησιμοποιώντας 1-αιθυλ-3-(3-διμεθυλαμινοπροπυλ)καρβοδιιμίδιο (EDC) και Ν-υδροξυσουλφοηλεκτριμίδιο (Sulfo-NHS).
| Βήμα πρωτοκόλλου | Ρυθμιστής / Αντιδραστήριο | Παράμετροι Αντίδρασης | Βασικός στόχος |
|---|---|---|---|
| 1. Bead Wash | 100 mM MES, pH 6.0 | 2.5 × 106 χάντρες, δίνη & μαγνητικός διαχωρισμός | Αφαιρέστε τα συντηρητικά αποθήκευσης και εξισορροπήστε την επιφάνεια |
| 2. Ενεργοποίηση COOH | 50 mg/mL EDC + 50 mg/mL Sulfo-NHS σε MES | Εκκολάπτω 20 min σε RT με ήπια περιστροφή | Μετατρέψτε το COOH σε σταθερό, εστέρες Sulfo-NHS που αντιδρούν με αμίνη |
| 3. Ενεργοποίηση πλύσης | 50 mM MES, pH 6.0 | Πλύσιμο 2× με ρυθμιστικό διάλυμα ενεργοποίησης | Αφαιρέστε το EDC που δεν αντέδρασε, υποπροϊόντα ουρίας, και περίσσεια Sulfo-NHS |
| 4. Πεπτιδική Σύζευξη | PBS (pH 7,2–7,4) + 10–20\ µg peptide | Εκκολάπτω 2 h σε RT ή όλη τη νύχτα στους 4°C | Σχηματίστε ομοιοπολικούς δεσμούς αμιδίου με πρωτοταγείς αμίνες |
| 5. Σβήσιμο | 1 Μ Αιθανολαμίνη (pH 9.0) ή 50 mM Τρις (pH 8.0) | Εκκολάπτω 30 λεπτά στο RT | Υδρολύστε εστέρες NHS που δεν αντέδρασαν για να αποτρέψετε τη μη ειδική δέσμευση |
| 6. Μπλοκάρισμα / Αποθήκευση | PBS, 1% BSA, 0.05% Αζίδιο του νατρίου, pH 7.4 | Φυλάσσεται στους 2–8°C σε σκοτάδι | Σταθεροποιήστε συζευγμένες μικροσφαίρες για μακροχρόνια αποθήκευση |
Οδηγίες εκτέλεσης κρίσιμης σύζευξης
- Έλεγχος buffer ενεργοποίησης: Εκτελέστε ενεργοποίηση καρβοξυλίου στο pH 6,0–6,3 σε buffer MES. Η απόδοση του EDC μειώνεται σημαντικά στο pH > 7.0.
- Παρασκευή φρέσκου αντιδραστηρίου: Το EDC και το Sulfo-NHS είναι υγροσκοπικά και υδρολύονται γρήγορα σε υδατικά διαλύματα. Διαλύστε ξηρά δείγματα αμέσως πριν την προσθήκη; μην αποθηκεύετε ανασυσταμένα μητρικά διαλύματα.
- Φάση σύζευξης χωρίς αμίνες: Κατά τη διάρκεια του Βήματος 4, το ρυθμιστικό διάλυμα σύζευξης ΠΡΕΠΕΙ να είναι απαλλαγμένο από πρωτοταγείς αμίνες ή πυρηνόφιλα. Αποφύγετε το Tris, γλυκίνη, ή αζίδιο του νατρίου στο buffer ζεύξης, καθώς τα ανταγωνιστικά πυρηνόφιλα θα καταναλώσουν ενεργούς εστέρες NHS και θα μειώσουν την απόδοση σύζευξης πεπτιδίων.
⚠️ Προειδοποίηση: Μην εισάγετε ποτέ BSA, ορρός, ή ζελατίνη πριν από το Βήμα 5. Η προσθήκη αναστολέων πρωτεΐνης κατά τη φάση σύζευξης έχει ως αποτέλεσμα τη σύζευξη βαριάς πρωτεΐνης στα σφαιρίδια, καλύπτοντας πλήρως το πρότυπο συνθετικού πεπτιδίου.
Φάση 4: Multiplex Cross-Reactivity & Πρόληψη μη ειδικής δέσμευσης
Σε πάνελ πολυπλεξίας Luminex (π.χ., 10-plex σε 50-plex), διασταυρούμενη αντιδραστικότητα μπορεί να συμβεί σε δύο διακριτές διεπαφές: αντίσωμα προς πεπτίδιο μη στόχο δεσμευτικό και μη ειδική προσρόφηση πεπτιδίου σε σφαιρίδιο. Συνθετικά πεπτίδια Κατασκευαστής
1. Matrix Cross-Reactivity Screening (5×5 Επικύρωση σκακιέρας)
Πριν το κλείδωμα σε πάνελ πολυπλεξίας, εκτελέστε μια πλήρη μονή αναλυτή vs. διαλογή πολυπλεξίας μήτρας:
- Τα μεμονωμένα αντισώματα πρωτογενούς ανίχνευσης πρέπει να επωάζονται μεμονωμένα έναντι όλων των ακινητοποιημένων περιοχών πεπτιδικών σφαιριδίων.
- Η διάχυση σήματος σε μη στοχευόμενες περιοχές σφαιριδίων δεν πρέπει να υπερβαίνει 1.5% του συγκεκριμένου σήματος στόχου στη μέγιστη συγκέντρωση βαθμονομητή (Β μέγ).
- Εάν εμφανιστεί διασταυρούμενη αντιδραστικότητα, αξιολογήστε εάν η ακολουθία έχει γραμμική ομολογία (>40%) με αναλυτές πίνακα εκτός στόχου. Τροποποιήστε τα πλευρικά υπολείμματα ή συντομεύστε το πεπτιδικό κατασκεύασμα για να αυξήσετε την επιλεκτικότητα στόχου.
2. Αποκλεισμός και Μετριασμός Επιπτώσεων Matrix
Συνθετικά πεπτίδια με υψηλό pI (>9.0) φέρουν καθαρά θετικά φορτία σε φυσιολογικό pH (7.4), προκαλώντας ηλεκτροστατικά οδηγούμενη μη ειδική δέσμευση σε υπολειμματικές αρνητικά φορτισμένες ομάδες καρβοξυλίου σε σφαιρίδια MagPlex.
- Συμπλήρωμα απορρυπαντικού: Συμπεριλαμβάνω 0.05% να 0.1% Tween-20 ή Triton X-100 σε ρυθμιστικά διαλύματα προσδιορισμού και πλύσης για ελαχιστοποίηση των υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων.
- Πολυ-ιονικοί αποκλειστές: Προσθέτω 10\ μg/mL ετερόφιλα ανασταλτικά αντιδραστήρια ή χαμηλού μοριακού βάρους θειική δεξτράνη για τη μείωση του ιοντικού υποβάθρου σε δείγματα ανθρώπινου ορού ή πλάσματος.
Φάση 5: Ποιοτικός έλεγχος πολλαπλών επιπέδων (QC) & Ακρίβεια βαθμονόμησης
Η ακριβής βαθμονόμηση ανοσοπροσδιορισμού απαιτεί αυστηρή απόλυτη ποσοτικοποίηση του προτύπου υλικού αναφοράς. Η στήριξη αποκλειστικά στη μεικτή ζυγισμένη μάζα οδηγεί σε σημαντικές αποκλίσεις μεταξύ των παρτίδων.
Gross Peptides Mass (1.0 mg ζυγίστηκε)
Νερό & Υγρασία (5–15%)
μετρητές: TFA / Οξικό άλας (10–25%)
Αληθινή μάζα πεπτιδίων (~60–80% πραγματική ενεργή ακολουθία)
1. Υποχρεωτική μετατροπή μετρητή (TFA σε οξικό / HCl)
Τυπική σύνθεση πεπτιδίων στερεάς φάσης (SPSS) αποδίδει πεπτίδια ως τριφθοροξικό (TFA) άλατα λόγω 0.1% Χρήση TFA σε κινητές φάσεις RP-HPLC.
- Μειονεκτήματα TFA: Υπολειμματικό TFA (CF_3COO^-) αλλάζει το pH της τοπικής ανάλυσης, διακόπτει τις δοκιμασίες επικύρωσης που βασίζονται σε κύτταρα, και προσθέτει 15–30% βάρος μη πεπτιδικού αντισταθμιστικού ιόντος στο δείγμα.
- Πρωτόκολλο μετατροπής: Πραγματοποιήστε χρωματογραφία ανταλλαγής ιόντων ή επαναλαμβανόμενη λυοφιλοποίηση από 10 mM HCl ή 1% διάλυμα οξικού οξέος για τη μετατροπή του αντίθετου ιόντος σε οξικά ή υδροχλωρικά άλατα. Η απόδοση μετατροπής θα πρέπει να επαληθεύεται με χρωματογραφία ιόντων ή τριχοειδή ηλεκτροφόρηση για να διασφαλιστεί ότι το υπολειπόμενο TFA είναι κάτω 1.0%. Παράθεση συναίνεση από ομοτίμους για την ανταλλαγή αντιιόντων, η ανταλλαγή TFA με βιοσυμβατό οξικό άλας είναι απαραίτητη για τη βαθμονόμηση αναπαραγώγιμης ανοσοδοκιμασίας.
2. Καθαρό περιεχόμενο πεπτιδίου (NPC) μέσω ανάλυσης αμινοξέων (ΑΑΑ)
Η βαρυμετρική ζύγιση των λυοφιλοποιημένων πεπτιδίων περιλαμβάνει παγιδευμένη υγρασία και αντίθετα ιόντα. Χρωματογραφική καθαρότητα (RP-HPLC) μετρά το σχετικό ποσοστό επιφάνειας κορυφής μεταξύ των πεπτιδικών ειδών, αλλά κάνει δεν αντανακλούν μη πεπτιδική μάζα.
Για τον καθορισμό απόλυτων συγκεντρώσεων αποθέματος βαθμονομητή, μέτρο Καθαρό περιεχόμενο πεπτιδίου (NPC) χρησιμοποιώντας ποσοτική ανάλυση αμινοξέων (ΑΑΑ). Όπως αναλυτικά στο Καθορισμός καθαρού περιεχομένου πεπτιδίου μέσω ανάλυσης αμινοξέων πρωτόκολλο: Τροποποίηση ακριβείας πεπτιδίων ή πρωτεϊνών που περιέχουν κυστεΐνη με χρήση αλάτων αλκυλοθειοφαινίου
Καθαρό περιεχόμενο πεπτιδίου (NPC %) = Μάζα επαληθευμένων αμινοξέων/Συνολική μεικτή ζυγισμένη μάζα × 100
Υπολογίστε την πραγματική μάζα του ενεργού πεπτιδίου για την προετοιμασία του αποθέματος χρησιμοποιώντας:
Αληθινή ενεργή μάζα = Μεικτή μάζα × (Καθαρότητα RP-HPLC %/100) × (NPC %/100) Συνθετικό Πολυπεπτίδιο Χονδρική
3. Κριτήρια έκδοσης από παρτίδα σε παρτίδα
Για Κάθε παρτίδα προτύπων συνθετικών πεπτιδίων θα πρέπει να πληροί τα ακόλουθα όρια απελευθέρωσης πριν από την ενσωμάτωση της ανάλυσης:
- Καθαρότητα (RP-HPLC): ≥ 95.0% κύρια περιοχή κορυφής στο 214 nm και 280 nm.
- Ταυτότητα (HRMS/LC-MS): Η μονοϊσοτοπική μάζα ταιριάζει με το θεωρητικό μοριακό βάρος εντός ± 0.5 Και.
- Καθαρό περιεχόμενο πεπτιδίου (ΑΑΑ): Ποσοτικοποιημένο ποσοστό NPC που παρέχεται στο Πιστοποιητικό Ανάλυσης (CoA).
- Υπολειμματικό πάγκο: Υπολειμματικό TFA < 1.0\ w/w%.
- Ομοιομορφία σύζευξης σφαιριδίων: Βιογραφικό εντός της ανάλυσης < 5.0% απέναντι 100 επαναλαμβάνουν αναγνώσεις σφαιριδίων; μεταβλητότητα κλίσης από παρτίδα σε παρτίδα < 10.0% σε τυπική γραμμική καμπύλη.
Επιτάχυνση Προτυποποίησης Ανοσοδοκιμασίας με Αλλαγές MOL
Προμηθευτής M Peptides Η ανάπτυξη ισχυρών προτύπων πεπτιδίων για δοκιμές πολυπλεξίας Luminex απαιτεί προηγμένη χημεία σύνθεσης, εξειδικευμένες τροποποιήσεις, και ολοκληρωμένο αναλυτικό QC. Η συνεργασία με ένα εξειδικευμένο CDMO εξαλείφει τα σημεία συμφόρησης στη σύνθεση και εγγυάται υλικό ποιότητας ανάλυσης.
Ο MOL Αλλάζει προσαρμοσμένη πλατφόρμα σύνθεσης και τροποποίησης πεπτιδίων παρέχει ολοκληρωμένες λύσεις από άκρο σε άκρο για προγραμματιστές ανοσοδοκιμών:
- 300+ Λειτουργικές Τροποποιήσεις: Τοποειδική N/C-τερματική βιοτινυλίωση, μονο-διασπαρμένοι συνδέτες PEG (PEG2–PEG24), επισήμανση φθορίζουσας βαφής, και προσαρμοσμένες αντιδραστικές λαβές.
- Υπεραποστειρωμένη Παραγωγή: Πεπτιδική σύνθεση που εκτελείται εντός της Τάξης 100 περιβάλλοντα καθαρού δωματίου, εξασφαλίζοντας εξαιρετικά χαμηλά επίπεδα ενδοτοξίνης (<0.01 EU/mg) για ευαίσθητες βιοδοκιμές.
- Αυστηρή αναλυτική επικύρωση: Κάθε προσαρμοσμένο πρότυπο παραδίδεται με πλήρη τεκμηρίωση CoA, συμπεριλαμβανομένων φασμάτων μάζας LC-MS υψηλής ανάλυσης, αναλυτικά χρωματογραφήματα RP-HPLC, Πιστοποιημένο από AAA Καθαρό περιεχόμενο πεπτιδίου, και επαληθεύτηκε ανταλλαγή αντιιόντων TFA προς οξικό.
Είτε η δημιουργία πάνελ βιοδεικτών σε πρώιμο στάδιο είτε η κλιμάκωση εμπορικών διαγνωστικών κιτ πολλαπλών, αξιοποίηση υψηλής καθαρότητας, Τα πλήρως χαρακτηρισμένα συνθετικά πεπτίδια εξασφαλίζουν μακροπρόθεσμη αναπαραγωγιμότητα και συμμόρφωση της ανάλυσης.
Σύνοψη λίστας ελέγχου πρωτοκόλλου
- Επιλέξτε επίτοπο πυρήνα 8–15 αμινοξέων; προσθέστε υδρόφιλο συνδέτη PEG2/PEG4 στο άκρο σύζευξης.
- Ενσωματώστε ειδική για τη θέση βιοτινυλίωση ή απλή Ν-τερματική πρωτοταγή αμίνη.
- Εκτελέστε μετατροπή αντίθετου ιόντος από TFA σε οξικό άλας (υπολειπόμενο TFA <1.0%).
- Προσδιορίστε την Καθαρή Περιεκτικότητα Πεπτιδίου (NPC) μέσω ΑΑΑ; προσαρμόστε ανάλογα την προετοιμασία του βαθμονομητή.
- Ενεργοποιήστε τα σφαιρίδια MagPlex COOH 100 mM MES (pH 6.0) χρησιμοποιώντας φρέσκο EDC/Sulfo-NHS.
- Ζευγάρι πεπτιδίου σε PBS χωρίς αμίνες (pH 7,2–7,4); σβήνουν τους εστέρες που δεν αντέδρασαν με αιθανολαμίνη ή τρις/καζεΐνη.
- Επικυρώστε τη διασταυρούμενη αντιδραστικότητα χρησιμοποιώντας μια οθόνη μήτρας 5×5 (σήμα εκτός στόχου <1.5%).
