Mitä hajoamisen seulontareagenssin todellisuudessa on tehtävä
Ennen laadunvarmistuksen arviointia, se auttaa erottamaan mukana olevat reagenssiluokat. Normaalit proteomi- ja kemialliset koetinohjaimet erottavat fluoresoivat reportterit, toimintaan perustuvat anturit, ja affiniteettirikastusreagenssit, jokainen muuntava ubikvitiini-proteasomijärjestelmä (UPS) solujen aktiivisuus mitattavissa olevaksi lukemaksi, lysaatit, tai soluttomat reaktiot.
-
Fluoresoivat etiketit voit visualisoida tai määrittää aktiivisia entsyymejä, proteasomin alayksiköt, tai reportterisubstraatit geelin sisäisellä fluoresenssilla, mikroskopia, tai signaalin saamisen/häviön toimittajat.
-
Biotiini etiketit ovat rikastustyökaluja, aktiivisten deubikvitinaasien sieppaaminen (DUBit) tai modifioidut proteiinit streptavidiinin alasvedolla ennen immunoblottausta tai massaspektrometriatunnistusta.
-
Ubikitiini ja NEDD8-mimeettiset koettimet ja fluorogeeniset tai FRET-substraatit tutkivat entsyymejä ja ligaaseja, joiden täytyy erottaa ubikvitiini ubikitiinin kaltaisista modifioijista – kemiaa, joka päättää, tapahtuiko kohdennettu hajoamistapahtuma todella.
-
Hajoavia substraatteja sisältää destabiloivan tai degronin sekvenssin, joten yhdisteohjattu tai proteasomista riippuvainen häviö saa aikaan kvantifioitavissa olevan signaalin muutoksen.
Jokainen näistä rooleista käy kauppaa pienellä rakenteellisella yksityiskohdalla: mikä jäännös on merkitty, missä muutos sijaitsee, onko isopeptidi- tai oksiesterisidos oikea, ja onko taistelukärki oikeassa päätepisteessä. Reagenssi, jonka ”95 % puhtaus” kätkee hallitsevan desamidoidun tai deleetioisomeerin, voi muuttaa sitoutumista, vakautta, tai näennäinen huononemisnopeus, joka on riittävä muokkaamaan koko näytön tulkintaa.
Leimatut peptidit tarvitsevat etikettikohtaisen vahvistuksen
Fluoresoiva tai biotiinimerkki ei ole passiivinen lisäosa. Konjugaatio muuttaa sekä retentioaikaa että ionisaatiota kromatografiassa, ja se tuo ennustettavan massasiirtymän - mutta vain jos tarkoitettu laji on se, mikä muodostui.
Reagenssin laatu tarkoittaa tässä varmistamista merkitty lajit, ei vain emopeptidiä. Se yleensä vaatii:
-
Peptidisynteesi lisätyn leiman massaspektrometrinen todentaminen odotetun massasiirtymän avulla;
-
LC-MS tai UPLC tarkistaa varmistaakseen, että leimattu molekyyli eluoituu ja ionisoituu määritellyllä tavalla, hallitseva laji;
-
erillinen tunnistetiedot, koska sen muuttunut käyttäytyminen voi peittää samanaikaisesti eluoituvia sivutuotteita.
Biotiinille, huolenaihe on rikastususkollisuus: osittain leimattu tai väärin biotinyloitu erä voi sitoa streptavidiinia eri tavalla ja kaataa väärän proteiinisarjan. Fluoroforeille, vikatila on erilainen, mutta yhtä häiritsevä - epäpuhtaus, joka fluoresoi automaattisesti määrityksen aallonpituudella, jäljittelee aitoa signaalia ja lisää osumia. Seulontalaboratoriot pyytävät yhä useammin myyjiä ilmoittamaan lopullisen konjugaatin tarkan leimatun massan ja kromatogrammin, ei vain sekvenssin puhtautta.
Määrityskohtaiset muutokset on tarkistettava, Ei oletettu
Hajotusreagenssit eivät usein ole tavallisia peptidejä. Niissä on ubikitiinia jäljitteleviä tai NEDD8-mimeettisiä elementtejä, elektrofiiliset taistelukärjet, affiniteettikahvat, linkittäjät, ja FRET tai fluorogeeniset parit. Todistustaakka on vahvistaa, että tarkoitettu rakenne hallitsee erää eikä tahatonta isomeeriä, katkaisu, tai sivutuote on kertynyt tasolle, joka häiritsee määritystä.
Hajoajien pienimolekyyliselle puolelle, analyyttinen käytäntö on jo selvä: vankka pakkaus käyttää LC-MS:ää tai HPLC:tä orgaanisen puhtauden varmistamiseksi, NMR tai qNMR rakenne ja massatasapaino, ja usein kiraalinen tai metallianalyysi stereokeskuksen epimerisaation ja hivenmetallikontaminanttien havaitsemiseksi, jotka voivat sammuttaa sinkin koordinaation. Peptidi- ja proteiinireagenssit, jotka syöttävät samoja seuloja, ansaitsevat saman kurinalaisuuden – modifikaatiokohdan tarkistamisen, kytkennän ja päätteiden vahvistus, ja selkeys siitä, voisiko hallitseva epäpuhtaus häiritä biologista lukemaa.
Sekvenssitarkkuudesta ei voida neuvotella
Seulontakirjastot ja koetinsarjat järjestetään yleensä määriteltyä ensisijaista rakennetta vastaan, joka koodaa degronin, tunnustusmotiivi, entsyymileikkauskohta, tai fosforylaatiosta riippuvainen signaali. Sekvenssitarkkuus tarkoittaa, että rakenne on se, mikä todellisuudessa toimitetaan – ilman poistoa, ei vaihtoa, ei liittämistä, ja oikea N- ja C-päät.
Fidelity on paikka, jossa tutkimustason pikakuvakkeet useimmiten esiin tulevat. Pelkästään ehjän massan vahvistava toimittaja voi jättää huomiotta deleetioisomeerin, jolla on sama nimellismassa, tai väärälle jäännökselle asennettu fosfo-sivusto. Sekvenssitason luottamus vaatii peptidikartoituksen tai MS/MS-fragmentoinnin, aminohappoanalyysi koostumuksen selvittämiseksi, ja — voimakkaasti muokatuissa rakenteissa — vahvistus, että jokainen asennettu ryhmä sijaitsee aiotulla paikalla. Kun epäonnistunut degrader-seula tai hämmentävä DUB-tulos jäljittää "substraattisekvenssi oli yhden jäännöksen verran väärä,Kustannukset ovat viikkojen toistamattomia tietoja, joita mikään myöhemmän vaiheen ohjelmisto ei voi korjata.
Ortogonaalinen analyyttinen vahvistus lisää luottamusta
Yksittäinen analyyttinen signaali harvoin ratkaisee identiteetin. Euroopan lääkeviraston ohjeet kehitystä Synteettiset peptidit ja synteettisten peptidien valmistus suosittelee vähintään kahta ortogonaalista tunnistusmenetelmää, ja ortogonaalinen koko-, maksu-, ja hydrofobisuuteen perustuvat lähestymistavat puhtauden karakterisointiin.
Ortogonaalinen vahvistus merkitsee enemmän leimatuille ja modifioiduille reagensseille kuin yksinkertaisille lineaarisille peptideille, koska mikään kromatografinen menetelmä ei ratkaise jokaista epäpuhtausperhettä. Kemisti, joka tarkistaa monimutkaisen seulontarakenteen, yhdistää tyypillisesti käänteisfaasi-HPLC:n toisen kolonnikemian kanssa, yhdistä massavahvistus MS/MS- tai peptidikartoituksen kanssa, ja lisää kohdennettuja menetelmiä, kuten kiraalista erotusta stereokemiallisen eheyden saavuttamiseksi tai koon poissulkemista monikulmaisella valonsironnalla aggregaatiotilaa varten. Kun reagenssi syöttää kvantitatiivisen lukeman, tämä kerrostettu todiste antaa sinun luottaa siihen, että identiteetti- ja puhtausväitteet ovat todellisia ja toistettavissa – ei yhtäkään huippualueen prosenttiosuutta.
Seulontakirjastot elävät tai kuolevat eräyhteensopivuuden mukaan
Seulontakirjastot rakennetaan monista kaivoista, monta injektiopulloa, ja – ellet suunnittele etukäteen – useita tuotantoeriä. Eristä toiseen vaihtelevuus on pitkittäisten seulojen hiljainen tappaja, koska vähäisen epäpuhtauden ajautuminen tai siirtynyt kromatografinen sormenjälki muuttaa määrityksen käyttäytymistä, vaikka jokainen erä nimellisesti läpäisi puhtausmäärityksensä.
Johdonmukaisuuskuri koostuu kolmesta osasta:
-
Erän jäljitettävyys — jokainen injektiopullo tai kirjastolevy liittyy tarkkaan erän tunnisteeseen ja eräkohtaiseen analyysitodistukseen, joten mikä tahansa tulos voidaan jäljittää materiaaliin, joka tuotti sen.
-
Sormenjälkien vertailu — uusia eriä verrataan aikaisempiin eriin ja vertailustandardeihin säilytysajan perusteella, massa, ja epäpuhtausprofiili, ei vain hyväksytty/hylätty puhtausluku.
-
Dokumentoitu raakadata — objektiivinen näyttö (kromatogrammit, massaspektrit) on kunkin erän mukana eikä yhteenvetoprosenttia, joten seulontalaboratoriot voivat arvioida johdonmukaisuuden itse. Peptidin tuotanto
Käytännön sääntö suurelle degrader- tai koetinkirjastolle on hankkia lähde kumppanilta, joka käsittelee sarjasormenjälkien ottamista rutiinina ja pystyy osoittamaan, kuinka tietty erä on verrattuna siihen, joka vahvisti aikaisemmat osumisesi..
Proteiinin hajoamisen seulontaluokka: Miltä "riittävän hyvä" näyttää lähteessäsi
Voit muuttaa kaiken tämän lyhyiksi odotuksiksi määrittäessäsi reagenssia tai arvioiessasi toimittajaa. Käytännössä, huononemistyönkulkuja suorittavat laboratoriot etsivät kumppaneita, jotka keskustelevat tietyn taustalla olevasta laadunvarmistuksesta mukautettu peptidisynteesi tilata sen sijaan, että luovutat yhden puhtausluvun.
Olennaiset ovat: identiteetti vahvistetaan enemmän kuin ehjällä massalla; etiketti ja jokainen modifikaatio, joka on vahvistettu lopullisessa konjugaatissa; sekvenssin tarkkuus dokumentoitu tarvittaessa aminohappo- tai kartoitustason analyysillä; ortogonaaliset analyyttiset menetelmät puhtaus- ja karakterisointivaatimusten takana; a peptiditestaus tietue, joka sisältää raakakromatogrammit ja massaspektrit erää kohti; ja erä-sormenjälkien yhdenmukaisuus säilyy koko kirjastossa.
Hyvämaineinen synteesialusta tuo sieppaustason ortogonaalisen erotuksen, MS/MS-tason vahvistus, endotoksiinin ja biotaakan rajat, ja erätason dokumentaatio taulukkoon - koska se on ero puhtaan seulan tuottavan reagenssin ja sellaisen reagenssin välillä, joka tuottaa hiljaa vääriä positiivisia sataan kaivoon..
Key Takeaway: Proteiinien hajoamisen seulonnassa, reagenssin laatu on määrityksen validiteetti. Tarkista leimatut lajit emosekvenssin sijaan, vahvista jokainen muokkauspaikka, käyttää ortogonaalisia analyyttisiä menetelmiä, ja valvoa erien sormenjälkien yhdenmukaisuutta – koska lukema heijastaa äänettömästi sen, kumpi näistä ohitettiin.
Seuraavat vaiheet
Aloita kirjoittamalla ylös reagenssiluokat, joista näyttösi todellisuudessa riippuu – reportteri, koetin, tai substraatti – ja kunkin tarvitsema analyyttinen dokumentaatio. Käytä sitä lähtökohtana lähteessäsi, ja pyydä toimittajia opastamaan sinua ortogonaalisten menetelmien ja erien välisten sormenjälkitodistusten läpi käyttämäsi materiaalin takana. Muutama minuutti laadunvarmistuksen tarkistamiseen etukäteen voi säästää sinua toistamattomalta seulontatulokselta, jonka rentoutuminen kestää viikkoja.
