Usein kysytyt kysymykset
Yksinkertaisesti monimutkainen milligrammoista kiloihin
Mukautettu tarjouspyyntö
How to store peptides?
Lyofilisoidut peptidit
Peptidien pitkäaikaiseen varastointiin, suosittelemme säilyttämään ne kiinteänä jauheena. Lyofilisoituja peptidejä voidaan säilyttää -20 °C:ssa tai alemmassa lämpötilassa minimaalisen hajoamisen kanssa. Asiakkaita kehotetaan tarkastamaan räätälöidyt peptidit uudelleen joka kerta 2 vuotta laadunvalvonnan julkaisupäivästä.
Peptidit liuoksessa
Liuoksen peptidit ovat vähemmän stabiileja ja alttiita hajoamiselle. Peptidien liuottamiseen käytettyjen vesiliuosten tulee olla steriilejä ja puhtaita.
Ratkaisussa, tietty määrä peptidiä voi hajota, riippuen sekvenssissä olevista aminohapoista. Joitakin esimerkkejä on lueteltu alla:
– Metioniinia sisältävät peptidit, kysteiini- tai tryptofaanitähteillä tulisi olla rajoitettu varastointiaika liuoksessa hapettumisen vuoksi. Nämä peptidit tulee liuottaa hapettomaan liuottimeen. –
Glutamiini ja asparagiini voidaan deamidoida glutamiinihapoksi ja asparagiinihapoksi, vastaavasti. –
Kysteiini voi läpikäydä oksidatiivisen syklisoinnin muodostaen kysteiini-kysteiinidisulfidisidoksen (joka voi muodostua disulfidisidosten sisällä tai niiden väliin). –
Ladatut jäännökset (asparagiinihappo, glutamiinihappo, lysiini, arginiini, histidiini) ovat hygroskooppisia (imevät vettä ilmasta) ja taipumus muodostaa viskoosia, kirkasta öljyä. Tämä fyysinen muutos ei välttämättä vaikuta peptidin luonteeseen. On suositeltavaa, että tällaiset peptidit lyofilisoidaan vesijäämien poistamiseksi, poistetaan sitten kaasut typellä sen varmistamiseksi, ettei injektiopullossa ole vesihöyryä, ja sitten nopeasti korkki.
Toistuvan jäätymisen ja sulatuksen aiheuttamien vaurioiden estämiseksi, suosittelemme, että käyttäjät liuottavat vain sen määrän peptidiä, joka tarvitaan nykyiseen kokeeseen. Ylimääräinen liuos on säilytettävä ≥ -20 o C kunnes tarvitaan.
Vältä kosteutta.
Koska kosteus vähentää merkittävästi peptidien pitkäaikaista stabiilisuutta, suosittelemme, että peptidit tasapainotetaan eksikaattorissa huoneenlämpötilaan ennen pullojen avaamista. Peptidin annostelun päätyttyä, putkessa olevat loput peptidit tulee huuhdella varovasti vedettömällä typellä, sitten säiliö on suljettava, suljettu tiivistekalvolla, ja säilytetään -20 °C:ssa.
Eri peptidien liukoisuusominaisuudet vaihtelevat huomattavasti. Jäämät, kuten alaniini (Ala), kysteiini (Cys), isoleusiini (Kanssa), leusiini (Leu), metioniini (Met), fenyylialaniini (Phe), ja valiinia (Val) lisää peptidin hydrofobisuutta ja liukoisuutta vesiliuoksiin, ja on suositeltavaa, että asiakas noudattaa näitä ohjeita mukauttaessaan peptidejä.
Liukoisuusominaisuudet
Peptidien liukoisuus riippuu suuresti aminohapposekvenssistä. Luonnollisesti hydrofobisia peptidejä (A, F, G, V, L, minä, M, W, P korkeammalla taipumuksella) vaativat orgaanisia liuottimia liukenemiseen. Happamat peptidit (suurempi taipumus D:lle, E peptidisekvenssissä) vaativat emäksisiä vesipitoisia puskureita liukenemiseen, kun taas emäksiset peptidit (suurempi taipumus K, H, ja R) vaativat happamia vesipitoisia puskureita liukenemiseen.
Liuottimen valinta
Ottaen huomioon analyysisi rajoitukset, suosittelemme seuraavien ohjeiden käyttämistä parhaan liuottimen määrittämiseksi peptidien liuottamiseksi
Hydrofobiset peptidit
Hydrofobisten peptidien liuottamiseksi uudelleen, lisätä 100 µl DMSO:ta ja sonikoita, kunnes muodostuu homogeeninen liuos. Seuraavaksi, lisää valitsemasi puskuri tehdäksesi a 1 mg/ml liuosta (mitä korkeampi peptidipitoisuus, sitä suurempi määrä DMSO:ta tarvitaan).
Hydrofiilinen (Hapan) Peptidit
Happamien peptidien liuottamiseksi uudelleen, lisätä 100 µl 1% NH 4 OH sille 1 mg peptidiä ja pyörrettä. Kun liuos on kirkas, lisää valitsemasi puskuri tehdäksesi a 1 mg/ml liuosta.
Hydrofiilinen (Perus) Peptidit
Peruspeptidin muodostamiseksi uudelleen, lisää tislattua vettä 1 mg peptidiä ja pyörrettä.
Mikä on ero peptidin nettopainon ja bruttopainon välillä??
Teollisuuden standardi on toimittaa peptidit lyofilisoidussa muodossa bruttopainona. Peptidin bruttopaino on kaikkien lyofilisoidussa jauheessa olevien komponenttien kokonaispaino. Tämä sisältää kiinnostavan peptidin, kaikki peptidiepäpuhtaudet, vettä, liuotinjäämät, ja vastaioni.
Päinvastoin Net peptidin paino, laskettuna Nettopeptidipitoisuus, on paino vain peptidi lyofilisoidussa jauheessa oleva komponentti. Tämä tarjoaa tarkemmat pitoisuudet seuraaville peptidiliuoksille. Siten, Suosittelemme peptidien nettopainomääriä Mukautettu peptidi tilauksia.
Nettopeptidisisältö mittaus suoritetaan aminohappoanalyysillä (AAA; rajallinen tarkkuus, mutta vaatii vähän materiaalia) tai alkuaineanalyysi (CHN; vaatii milligrammaa peptidiä, mutta on tarkempi). Molemmat menetelmät antavat prosenttiarvon (eli, 75% nettopeptidipitoisuus).
Nettopeptidipitoisuus riippuu läsnä olevan vastaionin määrästä*, joka on riippuvainen peptidisekvenssistä. Pohjimmiltaan, mitä suurempi peptidivaraus, sitä pienempi peptidipitoisuus
*Huom: Peptidin nettopitoisuuden laskemiseen käytetty elementti perustuu peptidivastaioniin. Tämä tehdään sen varmistamiseksi, että vastaioni ei vaikuta peptidipitoisuuden määrään. Esimerkiksi, kun TFA tai asetaatti ovat vastaioni, typpeä käytetään, koska sitä löytyy peptidistä, mutta ei TFA:sta tai asetaatista. Hiiltä tai typpeä voidaan käyttää, kun kloridi on vastaioni samasta syystä.
Nettopeptidipainon laskelmat:
Peptidin nettomäärä (kokonaispeptidi) — menetelmä, jota käytämme mukautetuissa nettopeptiditilauksissa.
Kerro nettopeptidipitoisuuden prosenttiosuus (desimaalimuoto) peptidin bruttopainon mukaan, saadakseen nettopeptidimäärän (kokonaispeptidi).
Esimerkiksi:
varten 5 mg bruttopeptidiä/pullo:
Peptidin nettopitoisuus on 84%.
Kokonaispeptidin tarkka määrä = 0.84*5 mg = 4,2 mg kokonaispeptidiä
Kiinnostavan peptidin nettomäärä – tarkin — Asiakas voi käyttää tätä menetelmää itse laskeakseen kiinnostavan peptidin.
Kerro nettopeptidipitoisuuden prosenttiosuus peptidin bruttopainolla, ja peptidin puhtaus (HPLC:llä), laskeaksesi tarkan määrän sinua kiinnostavaa peptidiä. Peptidin nettoprosentti (desimaalimuoto) kerrotaan peptidin puhtaudella (desimaalimuoto).
Esimerkiksi:
varten 5 mg bruttopeptidiä/pullo:
Peptidin nettopitoisuus on 84%.
Kiinnostuksen kohteena olevan peptidin tarkka määrä on = 0.84*0.96*5 mg = 4,03 mg
MOL Changes käyttää kiinteän faasin Fmoc-kemiaa BOC-kemian sijaan. Fmoc-kemia mahdollistaa suojaryhmien poistamisen käyttämällä lieviä olosuhteita peptidin pidentämisen aikana, kun taas BOC-kemia vaatii vahvan hapon käyttöä suojaavien ryhmien poistamiseksi peptidin pidentämisen aikana. Lisäksi, Fmoc-kemiassa käytetään trifluorietikkahappoa (TFA) peptidin poistamiseksi hartsista, kun taas BOC-kemia käyttää fluorivetyhappoa (HF). HF on väritöntä, erittäin syövyttävä, ja kosketusmyrkkyä.
Siksi, MOL Changes käyttää Fmoc-kemiaa, koska se on miedompi, joustava, ja monipuolinen verrattuna BOC-kemiaan.
Kuinka lasken peptidini molaarisuuden?
Molaarisuus tarkoittaa liuoksen moolipitoisuutta, joka on liuenneen aineen moolimäärä 1 litra liuosta, ilmaistuna mol/l, tai M.
Molaarisuus [M] = Messu / (Tilavuus x moolimassa); Myyrä = keskittyminen (g/l) x Äänenvoimakkuus (L)/MW (g/mol)
Esimerkki:
Annettu: 1mg kuivaa peptidijauhetta, jonka molekyylipaino on: 20KDa (Peptidin moolimassa on 20 g/mol)
Molaarisuuden määrittäminen tunnetulla massalla ja tunnetulla tilavuudella
Tämän peptidin 1 ml:n liuokselle:
Molaarisuus = massa (0.001g) / (äänenvoimakkuutta (0.001L) x Molaarinen massa (MW 20,000) = 50 uM
Massan määrittäminen tietyn molaarisuuden saavuttamiseksi:
Jos testiäsi varten, tarvitset 0,01 mM toimivaa peptidiliuosta 1 ml:ssa vettä, laske sitten tarvittava massa seuraavasti:
Massa = molaarisuus x tilavuus x moolimassa
Massa = 0,01 mM x (1/1000 L) x 20 000 g/mol = 0,0002 g
Siten, tarvitset 0,2 mg/ml peptidiä, jotta työliuos on 0,01 mM.
Missä muodossa peptidit toimitetaan?
Toimitamme lyofilisoituna tai raakajauheena ja peptidiliuoksena.
Mistä tiedän, onko peptidini liukoinen?
Peptidin liukoisuus tiettyyn liuottimeen riippuu aminohapposekvenssistä ja on usein vaikea ennustaa. Luettelopeptidien tapauksessa, liukoisuustiedot on lueteltu QC-tietolomakkeessa. Mukautetuille peptideille, katso kohta otsikko “Kuinka minun pitäisi liuottaa peptidini”.
Mitä eroa on peptidisisällöllä ja peptidin puhtaudella?
Peptidipitoisuus ei ole osoitus peptidin puhtaudesta, koska nämä ovat kaksi erillistä mittausta. Puhtaus määritetään analyyttisellä HPLC:llä ja se osoittaa muiden peptidikontaminanttien läsnäolon/puutteen (eli. typistetyt peptidit).
Peptidin nettopitoisuus määrittää peptidin todellisen määrän (kiinnostava peptidi sekä peptidikontaminantit) läsnä näytteessä. Peptidin nettopitoisuus mitataan perinteisesti aminohappoanalyysillä (AAA; rajallinen tarkkuus, mutta vaatii vähän materiaalia) tai alkuaineanalyysi (CHN; vaatii milligrammaa peptidiä, mutta on tarkempi).
Kuinka yleensä puhdistat peptidisi?
MOL Changes -peptidit puhdistetaan yleensä preparatiivisella käänteisfaasi-HPLC:llä, käyttämällä 2 puskurit sisältävät 0.1% trifluorietikkahappo (TFA). Ensimmäinen puskuri (Puskuri A) koostuu 0.1 % TFA deionisoidussa vedessä ja toisessa puskurissa (Puskuri B) koostuu 0.1 % TFA asetonitriilissä (ACN).
Yleensä, raakapeptidit liuotetaan ensin joko puskurin A liuokseen, jonkin verran puskuria B, tai orgaaninen polaarinen liuotin, kuten DMSO. Jos käytettiin orgaanista polaarista liuotinta tai puskuria B, tämä kirkas liuos laimennetaan ensin puskurilla A. Seuraavaksi, peptidiliuos suodatetaan ja ladataan preparatiiviseen HPLC-järjestelmään. Optimoidun menetelmän gradientin käyttäminen, fraktiot kerätään sitten absorbanssilukemien perusteella. Jokainen fraktio analysoidaan sitten analyyttisellä HPLC:llä sen varmistamiseksi, että kunkin fraktion puhtaus vastaa vaadittua puhtausspesifikaatiota..
Nämä "puhtaat" fraktiot yhdistetään sitten yhteen ja lyofilisoidaan. Sen jälkeen "puhdas" jauhe testataan sekä puhtauden että identiteetin suhteen sen varmistamiseksi, että oikea peptidi on valmistettu.
Lopulta, AnaSpecin riippumaton QC-ryhmä testaa uudelleen peptidin varmistaakseen, että kaikki testausominaisuudet täyttävät vaaditut spesifikaatiot.
Kuinka kirjoitan peptidisekvenssini päät?
Sekvenssin päissä käytetty kansainvälinen nimikkeistö on seuraava:
– N-pää: H tarkoittaa vapaata amiinia (NH2-), Ac tarkoittaa asetyyliä [CH3C(O)-NH-], Pyr tarkoittaa pyroglutamiinihappoa
– C-pääte: OH tarkoittaa vapaata happoa (-COOH), NH2 tarkoittaa amidia [-CONH2]
– Aminohappojen sivuketjun modifikaatiot on kuvattu suluissa vastaavan aminohapon jälkeen. Esimerkiksi; fosforyloitu seriini = S(PO3H2) tai epsilon-N-asetyloitu lysiini = K(Ac)
Peptidituotannon aikana, synteesi- ja puhdistusliuoksissa olevat ionit sitoutuvat peptidin varautuneisiin aminohapposivuketjuihin, muodostaen suoloja. Nämä ionit tunnetaan peptidivastaioneina ja auttavat tasapainottamaan peptidin varausta.
Trifluorietikkahappo (TFA) käytetään yleisesti peptidisynteesissä ja puhdistuksessa.
Se muodostaa trifluoriasetaattisuoloja emäksisten aminohappojen kanssa (esim., lysiini, arginiini, histidiini) ja vapaa N-terminaalinen amiini. Siksi, trifluoriasetaatti on tyypillisesti oletusvastaioni.
Peptidiin sitoutuneiden TFA-molekyylien vähimmäismäärä on verrannollinen emäksisten tähteiden lukumäärään tietyssä peptidisekvenssissä. Siten, mitä emäksisempiä tähteitä on peptidissä, sitä pienempi lyofilisoidun jauheen nettopeptidipitoisuus. Näytteessä olevan TFA- tai vesipitoisuuden huomioon ottamiseksi, suosittelemme peptidipitoisuusmäärityksen suorittamista jokaiselle mukautetulle peptidille.
Vesi ja trifluorietikkahappo (TFA) ovat puhdistusprosessin sivutuotteita. Kuitenkin, TFA voi aiheuttaa myrkyllisyysongelmia elossa ja prekliiniset tutkimukset. Siksi, MOL Changes tarjoaa myrkytöntä asetaattia, kloridi, tai ammoniumsuolavaihtimia.
hy ovat peptidejä, jotka sisältävät Cys, Met, tai Trp on vaikea syntetisoida?
Peptidit, jotka sisältävät Cys, Met, tai Trp ovat haastavia syntetisoida ja saada erittäin puhtaita tuotteita. Tämä johtuu pääasiassa näiden funktionaalisten ryhmien epästabiilisuudesta ja hapettumisalttiudesta. Erityistä huomiota on kiinnitettävä näiden peptidien käyttöön ja varastointiin, jotta vältetään pullojen toistuva avaaminen.
missasi kysymyksesi? Laita meille linja ja me teemme
palata sisään 24 tuntia.
