He aha te Akoranga tino uaua a Protein Engineering ki te Arotautanga Peptide
Kua horomia e te mara peptide te taima o te pūmua engineering - cyclization, N-methylation, PEGylation, stapling — me te kore e mimiti i nga wa katoa ako. I kaha te mahi miihini pūmua mo nga mahi hokohoko na te mea me tika: he Fc-fusion ranei he tauwehe tipu whakapumau he utu nui ki te hanga, puhoi ki te whakamatautau, me te hua haumanu ina rahua. Na taua pehanga i puta he huinga tikanga e whakawhiti tika ana ki te mahi peptide, a he rite tonu nga tikanga e wehe ana i te arotautanga peptide mai i te rarangi o nga mahi matū.
E wha nga tikanga tino nui.
Tuatahi, Ka tiakina e nga miihini pūmua te epitope mahi me te miihini huri noa. Tuarua, ka mahia e ratou te hoahoa kino — te kowhiri i nga whakakapinga hei tango i nga taunahatanga hapa me te whakahiato, e kore anake ki te tāpiri hononga. Tuatoru, ka mahi ratou i nga hononga, mokowhiti, me te hangahanga honohono hei huānga mahi. Tuawha, e hiahia ana ratou ki te tohu orthogonal ko te ngota ngota te mea e whakaarohia ana e ratou. Ko ia tikanga ka noho hei akoranga i raro iho nei.
Akoranga 1: Tiakina te Pharmacophore i mua i to whakau i tetahi mea
Te Kohanga Peptide Ko te ngoikoretanga o te arotautanga peptide ko te whakakapinga "whakapumau" ka whakakore marie i te whakapiri tino nui.. Ko te hangarau FGF e whakaatu ana i te whaiti o te taha: ko te whakakapinga S137P ka whakaara ake i te whakamaarama o te waiariki i roto i te FGF2 ma te whakapumau i te heparin-bihere β-hairpin na roto i te kohinga CH-π i waenga i te P137 me te mowhiti indole W123., me noho tonu nga toenga e hanga ana i te atanga kaiwhakawhiwhi (Te Tirohanga Hanganga me te Hangaiao ki nga momo rereke FGF2 Stable). Ka whai hua te huringa whakapumau na te mea ka whakakaha i te scaffold, ehara i te mea ka tuhi ano i te mata here.
Ko te arorau ano e whakahaere ana i nga mahi peptide. I mua i te whakarereketanga, tautuhia te motika hohe iti - ko te tikanga e wha neke atu ranei nga toenga - me te whakarite kia rite. Ko nga momo rereke FGF1 Hyperstable e whakaatu ana i te ako i te tauine: Ko nga hoahoa penei i te Q40P/S47I/H93G/S99A/K118E i whakanui ake i te pumau o te waiariki i te wa e mau tonu ana te mahi mitogenic me te metabolic., na te mea ko nga whakakapinga whakapumau i whiriwhiria mo to raatau paanga ki te whakakakahu me te aukati proteolytic kaua ki te tata ki te waahi here. (Nga momo rerekee FGF1 i hangaia i te taumautanga mai i te ngohe).
Ko te waahanga mahi ko te whanau tairitenga. Te whakauru i tetahi huringa i peia e te whakapae i te wa kotahi — he whakakapinga kotahi, he herenga kotahi, he potae kotahi — ka pupuri i ia paanga ka taea, me te huinga o nga tairitenga e pa ana ki te tiritiri i tetahi maatua he nui ake nga korero mo te roopu o nga hoahoa kore hono. Ko taua maataapono hoki e whakahaere ana ko wai nga kaitono e tika ana kia whakahiatohia: te whakaraupapa i nga tairitenga e pai ana ki te whakahiato he waahanga o te arotautanga me te matū tonu.
E rua nga hainatanga rahunga e tika ana kia tirohia. Ka heke te hononga i te wa e pai ake ana ia inenga pumau, ko te tikanga ko te whakakapinga i pa ki te toenga whakapiri, i nekehia te ahua here, ka herea ranei te peptide ki roto i te ahuahanga e kore e taea e te kaiwhiwhi te whakauru. Ko te tuarua he ngawari ake: he maamaa te ahua o te mata engari ka ngaro te kaha i roto i te whakamatautau mahi, na te mea i tiakina e te huringa te raupapa i te wa e whakarereketia ana te ahua koiora.
Ka whai tika te manatoko. Whakatauahia ia panui pumau me te inenga here tika - te resonance plasmon mata, te calorimetry titration isothermal - me te panui pūkoro mahi. Ko te pāmahana whakarewa teitei ake ehara i te taunakitanga mo te pai ake o te ngota ngota.
Akoranga 2: Engineer mo te Ara Whakahekenga Tino, Ehara i te "Taumautanga"
Ehara i te mea he taonga kotahi te "Suty".. Ko te mahi a FGF2 i wehe i te wehenga mai i te wera wera: ko te whakakapinga D28E i whakaiti i te wehenga i te wa o te whakarite, he raruraru rereke mai i te whakapumautanga β-hairpin e S137P. Ko te noho pumau o te Peptide me rite ano te whiunga mate, na te mea he koretake te matū, te koretake o te tinana, me te whakawātea enzymatic e hiahia ana ia ki te whakatika rereke.
Te whakakore i nga toenga o te Asn me te Gln i roto i te whakarewa-whakarewa, Ko nga rohe ngawari ka whakaputa i te rereketanga o te utu me nga rereketanga raupapa, a ka huri i te hydrophobicity, utu, me te papatipu i te wa kotahi - ko te tikanga ka kore e kitea ki te paheketanga ma engari ka kitea ki te tirotiro papatipu (Nga Aratohu Ture mo te Tataritanga o nga Peptides Hauora). Ka whai te whakahiato i tetahi huarahi rereke, i peia e te oma hydrophobic me te ahua β-pepa kaua e te toenga tauhohenga kotahi (Nga mea e pa ana ki te pumau o te tinana o te Peptide Therapeutics). Ko te whakakorenga proteolytic he raruraru tuatoru ano, me te whakautu ki nga matū rereke.
Ko te hua whaihua ko nga reihi noa kaore e taea te whakawhiti. Ka hokona e ia tangata tetahi rawa me te utu mo tera atu waahi.
| Tauira hoahoa | He aha tana hoko | He aha te nuinga o te utu |
|---|---|---|
| Paihikara / tāpara | Te whakapumautanga, ātete proteolytic | Ka taea te maukati i te ahuahanga kore-koiora; tāpiri i te matatini waihanga |
| D-amino acids, toenga kore-kanoni | Kua whakaitihia te tohu protease | Ko nga hoapaki kua whakarereketia; ahua uaua ake |
| N-methylation | Te herenga hauwai whakaheke, pai ake te uruhanga | Ka taea te whakararu i nga taunekeneke here matua; te whakahiato nui ake |
| Te kati kati | Te aukati Exopeptidase | He iti te whakamarumaru ki te pakaru o roto |
| PEGylation or lipidation ranei | He roa ake te haurua, teitei teitei | Te ngaronga o te ngohe mai i te whakamarumaru mate; he rereke te taapiri |
| Kua taapirihia te hydrophobic Peptides Hangaia toenga | Te urunga o te membrane | Huihuinga, rahunga wairewa, toi whakamatautau |
Ko te arotautanga whai hua ko te toenga o te kaha, whiriwhiringa, pūmautanga proteolytic, whakarewatanga, uruhanga, me te whakawhanaketanga, ka whaia tahi, kaua ki te taonga kotahi i te wa kotahi (Mai i te Lead ki te maakete: Nga Tikanga Matū ki te Huri Peptides ki te Hangarau). Inaa ko te whainga ko te uruhanga, ko te whainga he matapihi matū ahupūngao, kaua ki te lipophilicity teitei - he awhe o te cLogP 2 ki 5 me te polarity tuara kua tanumia - na te mea ko te turaki i te lipophilicity ki runga ake ka kaha ki te hokohoko i nga hua uruhanga mo te whakahiatotanga. (Peptides hei Papatono Molecular Scaffolds).
He aha te ahua o te kore. He wikitoria rawa-kotahi e whakararu ana i te whaarangi: he tairitenga paihikara me te tino pai o te parenga porotease kua kore e herea, he tairitenga lipidated ranei he roa te haurua o te ora me te kore kaha. Ko nga rautaki whakakorikori e mau ana i tetahi putanga motuhake o tenei tupono, a te hoahoa peptide kua paopaohia me te paihikara Ka utu noa ina whakamanahia te herenga ki te hangahanga koiora, kaua ki te whakaaro ki te pupuri.
Me pehea te manatoko. Whakahaerehia nga rangahau whakaheke i raro i te wera, pH, hāoratanga, me te ahotea marama, katahi ka whakau ma te tikanga tohu-pumau e tino whakatau ai i nga mea whakaheke ka puta. Ko te whakahiato i runga i te resin he mea tika kia tirotirohia moata: Ka taea e nga raupapa ka taea te tarai i te tauine kitea he iti ake te kounga o te koretake me te purenga uaua ake ina piki ake i te tauine..
Akoranga 3: Tuhia nga Kaihonohono, Tohutohu, me te Conjugation Geometry hei Mahi
Ko te roanga o te haurua o te ora ko te waahi ka tukuna e nga miihini peptide te raru o te miihini pūmua me te kore e mohio.. I roto i nga hanga hanumi, Ko te whakaurunga o te whakakotahitanga me te ahua o te raupapa hono he mea tino nui mo te pupuri i te mahi peptide - ka taea e te matū e mahi ana i tetahi ahuahanga te aukati i te mahi i tetahi atu. (Rautaki Hangarau Pūmua mo te Mahi GLP-1 Tonu).
Ko nga rereketanga FGF he rite tonu te tohu mai i te huarahi rereke. Ko te FGF2-STAB he mutant FGF2 tangata e iwa ira me te whiwhi i te pāmahana rewa ki runga 19 °C me a raro te ti'aturi ki te heparin mo te tohu ERK/MAP atu i te pūmua momo mohoao (Te Tirohanga Hanganga o FGF2-STAB). Ko te maarama ehara i te mea i whakakorehia e te mutant tana taunekeneke cofactor. Ko te mea i whakatauritehia e te hoahoa te ti'aturi o te cofactor, kaua ki te whakakore, a ko te whanonga tohu i inehia ano, kaua ki te whakaaro.
Ko te whakakotahitanga peptide e tika ana kia pera ano te maimoatanga. Te pae taapiri, te roa o te hono, me te matū mokowhiti ka whakatau mena ka mau te kaikawe nui hei whakangungu rakau i te mata here. E rua nga hononga e rite ana nga utu utu me nga hononga hono rite ka rereke te mahi mai i te waahi i tau mai ai te taapiri..
He aha te ahua o te kore. He conjugate me te whakaatu pai me te kaha ngoikore, he whakakotahitanga ranei ka aukatia e te kaikawe te epitope here. Ko te kore e kitea i te nuinga o te wa i roto i te parakore, i te tirotiro papatipu ranei, na te mea ko te mea i hangaia te ngota - kare noa e uru ki te whainga i te huarahi ano.
Me pehea te manatoko. Whakaūhia te pae honohono me te stoichiometry ma te tātari, ka ine i te here me te mahi mo te whakakotahitanga ake, kaua ki te tango mai i te peptide kore. Ko te whainga ko te haurua o te ora, kaua ki te hangahanga utunga motuhake, PEGylation me te hawhe-ora roa ka whai nga rautaki i te ture kotahi: Ko te matū toronga me te tohu taapiri he taurangi hoahoa, ehara i te tarapi.
Akoranga 4: Hangaia te Hanga Peptide hei Whangahanga Hoahoa, Ehara i te Rere Rescue
Ko te whakatakotoranga te hokinga mai o nga tauhokohoko i whakaroahia e koe. Ko te peptide he pai te mananga me te tohu pumau ka taka tonu mena ka memeha, te kaha whakahiato, ko te tairongo o te waikura anake ka whai paanga ki te kukū me te whakaaturanga e hiahiatia ana e te kaupapa.
He patai-whakahoahoa tenei, ehara i te waahanga whanaketanga. Ko nga ahuatanga e whakatau ana i te whanonga hanga — utu kupenga, te tohatoha hydrophobic, te aroaro o nga toenga e whakaraerae ana i te waikura, te maha o nga kaikoha here-waiwai e kitea ana - kua whakatauhia katoatia e te raupapa i whiriwhiria e koe. He maamaa ake te whakatau i waenga i nga tairitenga rereke e rua inaa ko te pakari o te whakatakotoranga tetahi o nga paearu mai i te timatanga..
Ko nga whakataunga whakatakotoranga ka taea te whakahaere. Ko te whakahiatotanga e peia ana e nga taunekeneke hydrophobic me te electrostatic e whakautu ana ki te kowhiringa surfactant me te arotautanga pH. Ko te wairewa iti ka whakautu ki te whakatikatika pH, nga whakarewa tahi, nga mea whakauru hanga ranei. Ko te koretake huri noa i te pH koretake e peia ana e te deamidation me te isomerization ka whakautu ki te mana pH, me te rokiroki lyophilized i raro i te pH 6 i roto i te ahua totoka tepe deamidation. Ka whakahaeretia te waikura ma te mana mokowhiti, te whakahaere hau hau, te amipere, te rokiroki pouri ranei, me te karo i nga whakatuwheratanga o te ipu.
Kei te tuwhera tonu te huarahi whakahaere, ka hangaia e ia te whaainga arotautanga katoa - te pumau o te GI, rautaki whakarerekē matū, whakaahuatanga poke, me nga whakaritenga bioanalytical ka huri tahi, kaua ki te takitahi. He pai te mapi o taua hononga, no te mea me pehea te huarahi o te whakahaeretanga ki te hanga ano i nga kaupapa matua whanaketanga peptide Ko te ahua o te herenga hei whakatau ko wai te tairitenga i roto i te huinga ko te tino kaiarahi.
He aha te ahua o te kore. Ka tohua e te hotaka he kaiarahi mo te kaha me te pumau, katahi ka kitea i te waihanga ka whakahiato te ngota ngota ki runga ake i te kukū whaihua, e kore ranei e taea te whakahaere i tana tohu waikura i roto i te ipu e hiahiatia ana e te kaupapa.
Me pehea te manatoko. Te whakarewatanga o te mata me te whakahiato moata — i mua i te arotautanga o te mata — puta noa i te pH me nga tikanga whakangao kei roto tonu. Ko te mata hangahanga kei te taha whakarunga hei tātari i te huinga tairitenga, kaua ki raro o te awa hei whakaora mo te kaitono i ora i runga i te kaha.
Akoranga 5: Whakaōrite Whakaū Tātari ki te Whakatupato Hoahoa
Ehara i te mea he pouakataki tuku te whakapumautanga tātari. Koia te tikanga e mohio ai koe ko te ngota ngota i hangaia e koe ko te ngota kei a koe - me te nui ake o to raupapa miihini, hononga, i muri i te whakamaoritanga ranei, ka nui ake te hiahia o taua patai ki nga whakautu motuhake. Ko te whakatau i te whakapumautanga tātari hei putanga hoahoa, kaua ko te tirotiro whakamutunga, ko te mea e pupuri ana i te tairitenga whaihua kia kore e eke whakamua ki runga i te kete korero pohehe..
Ka angitu nga tikanga Orthogonal na te mea he rereke nga patai ka whakautu. Ko te paheketanga parakore ka patai mena he momo chromatographic kotahi te tauira. Karekau he patai he aha te papatipu, he aha te rahi o nga momo kei roto i te otinga, i ora ranei te hanga.
| Tikanga tātari | Ka patai te whakautu | Nga raruraru ka kitea e ia |
|---|---|---|
| RP-HPLC | He momo chromatographic kotahi tenei? | Nga mea whakaheke, poroporoaki, te hāora me te whakahekenga teitei, paheketanga puranga |
| LC-MS / LC-MS/MS | Ko te papatipu me te raupapa te mea i hangaia? | Mukua, toronga rereke ranei, taumahi pae whakarereke, proteolysis |
| SEC-MALS | He aha te rahi o nga momo kei roto i te otinga? | Huihuinga, oligomers, nga kongakonga - me te papatipu tino nui, kaua ki te whakatau i te wa pupuri |
| CD | Kei te mau tonu te hanganga tuarua? | Te ngaro o te Helicity, whiwhi β-pepa, te whakaputanga e pa ana ki te whakahiato |
| NMR | Ka tiakina te taiao matū o te rohe? | Te pono o te hanganga, ngohe, nga whakarereketanga ngawari e nekehia ana te papatipu iti |
| SPR / ITC | Kei te mau tonu te kinetics me te thermodynamics? | Ko te ngaro o te hononga karekau e kitea te parakore |
I konei hoki e hono ana nga tumanakohanga ture me nga mahi pai. Ko te EMA Aratohu mo te Whakawhanaketanga me te Hanga o nga Peptides Hangaia E taunaki ana kia whakamahia kia rua nga tikanga orthogonal mo te tautuhi peptide i te waahanga me te tuku, me te pahekotanga i kowhiria e hiahiatia ana hei whakau i te raupapatanga. ahau Q2(R2) he rite tonu te tumanako mai i te taha whakamana: Ka taea te whakaatu te motuhake ma te whakatairite i tetahi hua ki te tuarua, he tikanga pai te tohu i runga i te kaupapa ine rereke.
Ko te ture whaihua ko te whakarahi i te kete whakau ki te tupono hoahoa. Me iti ake te whakakapinga kotahi i roto i te scaffold kua tino tohuhia; he whakarereketanga maha-pae, he paihikara, me nui ake ranei te whakakotahitanga. I te waahi ka taea te whakahiato, chromatography whakakore-rahi me te marara rama-maha-koki ka whakatau i nga momo taumaha-ngota-nui e kore e taea e te uara parakore anake te wehewehe mai i te poke kua whakatauhia.
Hei tauira mahi mo te ahua o tenei mahi, he kete whakapumau orthogonal o te momo MOL Hurihia nga taonga mo ia rota — HPLC whakamuri-waa mo te parakore, spectrometry papatipu mo te tuakiri, me nga tikanga taapiri penei i te SEC-MALS me te NMR kei reira te tupono o te hoahoatanga ka whakamanahia, e tautokohia ana e nga chromatograms mata motuhake me te hihinga papatipu, kaua ki nga whika whakarāpopoto - ko te ahua o nga taunakitanga ka taea e te hotaka te whakatau i te rereketanga o te puranga ki tetahi tino take.. Ko te mea nui ko te waahi ka hiahia te hotaka ki te tiaki i te riterite o te roopu-ki-te-paanga: kite peptide microheterogeneity i tua atu i te ōrau parakore kotahi mo te nui o te ōrau-rohe ka taea te korero ki a koe.
He aha te ahua o te kore. He ahua parakore e pai ana i te mea ko te momo tuuturu kei roto i te otinga he whakahiato, he momo whakaheke, he imaoma maminga noa ranei. Ko te tukunga o te puranga me te whakamatautau he iti te mahi.
Me pehea te manatoko. Hangaia te kete whakau mai i te raarangi morearea hoahoa: te tuakiri me te raupapa ma te papatipu me te tandem mass spectrometry, te parakore me te whakaheke i te tikanga chromatographic tohu pumau, whakahiato ma te tikanga rahi, te hanganga ma te CD, te NMR ranei i te wa e pa ana te ahua, me te mahi ma te whakahiato i runga i te pukoro ranei.
He Raupapa Arotautanga Mahi
Ko nga akoranga o runga ake ka taka ki roto i te kopikopiko, kaua ki te mahere rarangi.
- Tautuhia te tohu tohu. Whakaritehia nga whaainga o nga rawa - te kaha, pūmautanga proteolytic, whakarewatanga, uruhanga, te roanga o te whakakitenga - me te taumaha mo te tohu me te huarahi kua whakaritea.
- Whakatikahia te pharmacophore. Tautuhia te motika hohe iti, ka waiho hei here, ehara i te taurangi.
- Hanga iti, huringa huanga. Kotahi te whakakapinga, kotahi te hono, kotahi herenga, kotahi ranei te waahi taapiri mo ia tairitenga, no reira ka kitea te paanga.
- Whakatairanga moata me te whakarara. Mahi ine, pūmautanga, whakarewatanga, me te whakahiato i muri tata i te rauna whakahiato tuatahi, kaua i muri i te tino arotautanga. Ko te whakawhanake i te rahunga moata he iti ake te utu i te kitea i te hanga.
- Tātarihia i mua i to whakatika. Whakawehea te paheketanga matū mai i te koretake o te tinana mai i te waatea, me te whiriwhiri i te tuara e aro ana ki te huarahi tino nui.
- Whakaū orthogonally. Whakaoritehia te kete whakau ki te tupono hoahoa me te whakau i te tuakiri o te ngota, mā, āhua rahi, me te hanganga i mua i te ahu whakamua. Hanga Peptide
- Katia te koropiko. Whangaia nga hua ine ki roto i te rauna o muri o te hoahoa tairitenga, kaua ki te timata i te huinga whakapae hou. Ko te arotautanga raupapa he mea huri noa; me whakawhāitihia e ia rauna te mokowā hoahoa, kaua ki te tīmata anō.
FAQ
He aha te mea ka taea e te whakakapi whakapumau te whakaiti i te mahi peptide? Na te mea ko te pumau me te mahi he maha tonu te kawe e te rohe kotahi. Ko te whakakapinga S137P i roto i te FGF2 ka whakaara ake i te whakamaaramatanga o te waiariki ma te whakakaha i te β-hairpin na roto i te whakakakahu o te rohe., engari ko nga whakakapinga ka taka ki runga i te mata e anga ana ki te kaikawe ka huri i te ahuahanga here. Ko te ture haumaru ko te whakapumau i te scaffold me te waiho i te pharmacophore kia kore e pa, ka ine ano te mahi i raro i te ahotea, kaua ki te pāmahana rūma.
He kotahi te paheketanga parakore hei whakapumau he tika te peptide? Kao. Ko te ahua o te pure chromatographic kotahi ka whakautu mena he momo momo kotahi te tauira i raro i te huinga o nga tikanga - kaore he mea ke atu.. Kaore i te whakapumau i te papatipu, te raupapa, te ahua whakahiato, te hanganga ranei. E taunaki ana te EMA kia rua nga tikanga orthogonal mo te tautuhi i te tukunga, me te morearea o te hoahoa me whakatau mena ka hiahiatia ano nga tikanga i runga i te rahi, i te hanganga ranei.
Ko tehea wa ka timata te mahi hangahanga ki te arotautanga arahi? I mua ake i te whakaaro o te nuinga o nga kaupapa. Wairewa, te kaha whakahiato, tairongo hāora, a ko te paanga o te pH kua whakatauhia e te raupapa me nga whiringa whakarereke, na he tawhā hoahoa rite te nui o ratou tawhā whanaketanga. Ko te tirotiro i a raatau i te taha o te panui tairitenga tuatahi ka aukati i te kowhiri i tetahi arataki kaore e taea te hanga i te kukū whaihua.
Nga Mahi Panuku
Mena kei te pupuri koe i tetahi huinga tairitenga he ahua kaha ki runga i tetahi rawa me te ngoikore ki nga waahi katoa, he mea hangarau te korero whai hua: ko te huarahi whakaheke te rangatira, he aha te whakauru i roto i te kete whakau, a mena ka taea e te huinga whakamatautau o naianei te wehewehe i te tino whakapainga mai i te taonga inenga. Ko te korero i runga i to raupapatanga motuhake Ko te huarahi tere ki te arataki kaare.
