प्रोटीन इंजीनियरिंग का सबसे कठिन पाठ पेप्टाइड अनुकूलन पर क्यों लागू होता है?
पेप्टाइड क्षेत्र ने इसे अवशोषित कर लिया है लीवर प्रोटीन इंजीनियरिंग का - चक्रीकरण, एन मिथाइलेशन, पेगीलेशन, स्टेपलिंग - हमेशा इसे अवशोषित किए बिना अनुशासन. प्रोटीन इंजीनियरिंग को ट्रेडऑफ़ के बारे में सख्त होना पड़ा क्योंकि ऐसा करना ही था: एफसी-फ़्यूज़न या स्थिर विकास कारक बनाना महंगा है, परीक्षण करने में धीमा, और जब यह विफल हो जाता है तो चिकित्सकीय रूप से परिणामी होता है. उस दबाव ने आदतों का एक समूह उत्पन्न किया जो सीधे पेप्टाइड कार्य में स्थानांतरित हो गया, और ये वही आदतें हैं जो पेप्टाइड अनुकूलन को रासायनिक तरकीबों की सूची से अलग करती हैं.
चार आदतें सबसे ज्यादा मायने रखती हैं.
पहला, प्रोटीन इंजीनियर इसके चारों ओर कार्यात्मक एपिटोप और इंजीनियर को संरक्षित करते हैं. दूसरा, वे नकारात्मक डिजाइन का अभ्यास करते हैं - विशेष रूप से मिसफोल्डिंग और एकत्रीकरण देनदारियों को दूर करने के लिए प्रतिस्थापन का चयन करते हैं, सिर्फ अपनापन जोड़ने के लिए नहीं. तीसरा, वे लिंकर्स का इलाज करते हैं, स्पेसर, और कार्यात्मक तत्वों के रूप में संयुग्मन ज्यामिति. चौथी, उन्हें ऑर्थोगोनल प्रमाण की आवश्यकता होती है कि अणु वही है जो वे सोचते हैं. प्रत्येक आदत नीचे एक पाठ बन जाती है.
पाठ 1: किसी भी चीज़ को स्थिर करने से पहले फार्माकोफोर को सुरक्षित रखें
पेप्टाइड संश्लेषण पेप्टाइड अनुकूलन में सबसे आम विफलता एक "स्थिरीकरण" प्रतिस्थापन है जो चुपचाप एक महत्वपूर्ण संपर्क मिटा देता है. एफजीएफ इंजीनियरिंग से पता चलता है कि मार्जिन कितना कम है: S137P प्रतिस्थापन P137 और W123 इंडोल रिंग के बीच CH-π पैकिंग के माध्यम से हेपरिन-बाइंडिंग β-हेयरपिन को स्थिर करके FGF2 में थर्मल स्थिरता बढ़ाता है।, जबकि रिसेप्टर इंटरफ़ेस बनाने वाले अवशेषों को अछूता रहना चाहिए (स्थिर FGF2 वेरिएंट में संरचनात्मक और जैव रासायनिक जांच). स्थिरीकरण परिवर्तन काम करता है क्योंकि यह मचान को मजबूत करता है, इसलिए नहीं कि यह बाइंडिंग सतह को फिर से लिखता है.
वही तर्क पेप्टाइड कार्य को नियंत्रित करता है. कोई भी बदलाव करने से पहले, न्यूनतम सक्रिय रूपांकन को परिभाषित करें - आमतौर पर चार या अधिक अवशेष - और इसे निश्चित मानें. हाइपरस्टेबल FGF1 वैरिएंट बड़े पैमाने पर अनुशासन को दर्शाते हैं: Q40P/S47I/H93G/S99A/K118E जैसे डिज़ाइनों ने माइटोजेनिक और मेटाबोलिक फ़ंक्शन को बनाए रखते हुए थर्मल स्थिरता को काफी हद तक बढ़ाया, क्योंकि स्थिरीकरण प्रतिस्थापनों को बाइंडिंग साइट से निकटता के बजाय पैकिंग और प्रोटीयोलाइटिक प्रतिरोध पर उनके प्रभाव के लिए चुना गया था (इंजीनियर्ड FGF1 वेरिएंट स्थिरता को गतिविधि से अलग कर देता है).
कार्य की व्यावहारिक इकाई अनुरूप परिवार है. एक समय में एक परिकल्पना-संचालित परिवर्तन का परिचय - एक एकल प्रतिस्थापन, एक ही बाधा, एक एकल टोपी - प्रत्येक प्रभाव को जिम्मेदार रखती है, और माता-पिता को साझा करने वाले संबंधित एनालॉग्स का एक सेट असंबंधित डिज़ाइनों के एक बैच की तुलना में कहीं अधिक जानकारीपूर्ण है. यह सिद्धांत यह भी नियंत्रित करता है कि कौन से उम्मीदवार संश्लेषण के योग्य हैं: प्राथमिकता देना कि कौन से एनालॉग्स संश्लेषित करने लायक हैं रसायन विज्ञान जितना ही अनुकूलन का एक हिस्सा है.
दो असफल हस्ताक्षर देखने लायक हैं. प्रत्येक स्थिरता मीट्रिक में सुधार होने पर एफ़िनिटी कम हो जाती है, जिसका आमतौर पर मतलब होता है कि प्रतिस्थापन ने किसी संपर्क अवशेष को छू लिया है, बाइंडिंग पोज़ को स्थानांतरित कर दिया, या पेप्टाइड को एक ऐसी ज्यामिति में सीमित कर देता है जिसे रिसेप्टर संलग्न नहीं कर सकता है. दूसरा अधिक सूक्ष्म है: लीड विश्लेषणात्मक रूप से साफ दिखती है लेकिन केवल कार्यात्मक परख में अपनी शक्ति खो देती है, क्योंकि परिवर्तन ने बायोएक्टिव संरचना में परिवर्तन करते हुए अनुक्रम को संरक्षित रखा.
सत्यापन सीधे अनुसरण करता है. प्रत्येक स्थिरता रीडआउट को एक प्रत्यक्ष बाइंडिंग माप - सतह प्लास्मोन प्रतिध्वनि या इज़ोटेर्माल अनुमापन कैलोरीमेट्री - और एक कार्यात्मक सेलुलर रीडआउट के साथ जोड़ें. उच्च पिघलने वाला तापमान बेहतर अणु का प्रमाण नहीं है.
पाठ 2: डोमिनेंट डिग्रेडेशन पाथवे के लिए इंजीनियर, "स्थिरता" नहीं
"स्थिरता" कोई एक संपत्ति नहीं है. FGF2 कार्य ने विखंडन को थर्मल अनफ़ोल्डिंग से अलग कर दिया: D28E प्रतिस्थापन ने तैयारी के दौरान विखंडन को कम कर दिया, S137P द्वारा संबोधित β-हेयरपिन स्थिरीकरण से एक अलग समस्या. पेप्टाइड स्थिरता के लिए समान नैदानिक अनुशासन की आवश्यकता होती है, क्योंकि रासायनिक अस्थिरता, शारीरिक अस्थिरता, और एंजाइमैटिक क्लीयरेंस प्रत्येक एक अलग फिक्स की मांग करता है.
विलायक-उजागर में एएसएन और जीएलएन अवशेषों का डीमिडेशन, लचीले क्षेत्र चार्ज विविधता और अनुक्रम वेरिएंट उत्पन्न करते हैं, और यह हाइड्रोफोबिसिटी को बदल देता है, शुल्क, और द्रव्यमान एक साथ - जिसका अर्थ है कि यह शुद्धता प्रतिशत के लिए अदृश्य हो सकता है लेकिन सामूहिक जांच के लिए स्पष्ट हो सकता है (चिकित्सीय पेप्टाइड्स के विश्लेषण के लिए नियामक दिशानिर्देश). एकत्रीकरण एक अलग मार्ग का अनुसरण करता है, किसी एकल प्रतिक्रियाशील अवशेष के बजाय हाइड्रोफोबिक रन और β-शीट प्रवृत्ति द्वारा संचालित (पेप्टाइड चिकित्सा विज्ञान की भौतिक स्थिरता को प्रभावित करने वाले कारक). प्रोटियोलिटिक क्लीयरेंस फिर से तीसरी समस्या है, और यह विभिन्न रसायन शास्त्र पर प्रतिक्रिया करता है.
व्यावहारिक परिणाम यह है कि सामान्य लीवर विनिमेय नहीं हैं. प्रत्येक व्यक्ति एक संपत्ति खरीदता है और उसके लिए कहीं और शुल्क लेता है.
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डिजाइन लीवर |
यह क्या खरीदता है |
आमतौर पर इसकी लागत क्या होती है |
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चक्रगति / स्टैपल |
गठनात्मक स्थिरता, प्रोटीयोलाइटिक प्रतिरोध |
एक गैर-बायोएक्टिव ज्यामिति को लॉक कर सकते हैं; सिंथेटिक जटिलता जोड़ता है |
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डी-अमीनो एसिड, गैर-विहित अवशेष |
प्रोटीज़ पहचान में कमी |
परिवर्तित लक्ष्य संपर्क; कठिन लक्षण वर्णन |
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एन मिथाइलेशन |
हाइड्रोजन आबंधन में कमी, बेहतर पारगम्यता |
कुंजी बाइंडिंग इंटरैक्शन को बाधित कर सकता है; अधिक मांग वाला संश्लेषण |
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टर्मिनल कैपिंग |
एक्सोपेप्टिडेज़ प्रतिरोध |
आंतरिक दरार से थोड़ी सुरक्षा |
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पेगीलेशन या लिपिडेशन |
लंबा आधा जीवन, उच्च जोखिम |
स्थैतिक परिरक्षण से गतिविधि हानि; अतिरिक्त विविधता |
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हाइड्रोफोबिक जोड़ा गया सिंथेटिक पेप्टाइड्स अवशेष |
झिल्ली प्रवेश |
एकत्रीकरण, घुलनशीलता विफलता, परख कलाकृतियाँ |
प्रभावी अनुकूलन क्षमता का संतुलन है, चयनात्मकता, प्रोटीयोलाइटिक स्थिरता, घुलनशीलता, भेद्यता, और विकास क्षमता, एक समय में एक संपत्ति के बजाय एक साथ ट्रैक किया गया (लीड से बाज़ार तक: पेप्टाइड्स को चिकित्सीय में बदलने के लिए रासायनिक दृष्टिकोण). जहां लक्ष्य विशेष रूप से पारगम्यता है, लक्ष्य अधिकतम लिपोफिलिसिटी के बजाय एक भौतिक रासायनिक विंडो है - मोटे तौर पर cLogP की एक सीमा 2 को 5 दबी हुई रीढ़ की हड्डी की ध्रुवीयता के साथ - क्योंकि लिपोफिलिसिटी को अधिक बढ़ाने से एकत्रीकरण जोखिम के लिए पारगम्यता लाभ का व्यापार होता है (प्रोग्रामयोग्य आणविक मचानों के रूप में पेप्टाइड्स).
असफलता कैसी दिखती है. एकल-संपत्ति की जीत जो प्रोफ़ाइल को अस्थिर कर देती है: उत्कृष्ट प्रोटीज़ प्रतिरोध के साथ एक चक्रीय एनालॉग जो अब बंधता नहीं है, या लंबे आधे जीवन और बिना किसी शक्ति वाला लिपिडेटेड एनालॉग. कठोरता-उत्प्रेरण रणनीतियाँ इस जोखिम का एक विशिष्ट संस्करण रखती हैं, और स्टेपल और चक्रीकृत पेप्टाइड डिज़ाइन केवल तभी लाभ मिलता है जब बाधा को इसे संरक्षित करने के बजाय बायोएक्टिव संरचना के विरुद्ध मान्य किया जाता है.
इसे कैसे सत्यापित करें. गर्मी के तहत बलपूर्वक-निम्नीकरण अध्ययन चलाएँ, पीएच, ऑक्सीकरण, और हल्का तनाव, फिर एक स्थिरता-सूचक विधि से पुष्टि करें जो वास्तव में बनने वाले अवक्रमणों का समाधान करती है. ऑन-रेज़िन एकत्रीकरण भी शीघ्र जांच के लायक है: जो अनुक्रम खोज पैमाने पर ट्रैक किए जा सकते हैं वे पैमाने में ऊपर जाने के बाद कम कच्चे तेल की गुणवत्ता और कठिन शुद्धिकरण का उत्पादन कर सकते हैं.
पाठ 3: लिंकर्स का इलाज करें, टैग, और कार्यात्मक के रूप में संयुग्मन ज्यामिति
अर्ध-जीवन विस्तार वह जगह है जहां पेप्टाइड इंजीनियरों को अक्सर इसे साकार किए बिना प्रोटीन-इंजीनियरिंग समस्या विरासत में मिलती है. संलयन निर्माणों में, पेप्टाइड गतिविधि को बनाए रखने के लिए संलयन का स्थान और लिंकर अनुक्रम की प्रकृति महत्वपूर्ण है - रसायन विज्ञान जो एक ज्यामिति में काम करता है वह दूसरे में गतिविधि को दबा सकता है (सतत जीएलपी-1 गतिविधि के लिए प्रोटीन इंजीनियरिंग रणनीतियाँ).
एफजीएफ वेरिएंट विपरीत दिशा से एक ही बिंदु बनाते हैं. FGF2-STAB एक नौ-बिंदु मानव FGF2 उत्परिवर्ती है जिसका पिघलने-तापमान में वृद्धि होती है 19 डिग्री सेल्सियस और ए निचला जंगली प्रकार के प्रोटीन की तुलना में ईआरके/एमएपी सिग्नलिंग के लिए हेपरिन पर निर्भरता (FGF2-STAB का संरचनात्मक विश्लेषण). अंतर्दृष्टि यह नहीं है कि उत्परिवर्ती ने अपने सहकारक अंतःक्रिया को समाप्त कर दिया है. ऐसा इसलिए है क्योंकि डिज़ाइन ने सह-कारक निर्भरता को समाप्त करने के बजाय उसे पुनर्संतुलित कर दिया है, और सिग्नलिंग व्यवहार को मानने के बजाय फिर से मापा गया.
पेप्टाइड संयुग्मन समान उपचार का हकदार है. अनुलग्नक स्थल, लिंकर की लंबाई, और स्पेसर रसायन यह निर्धारित करता है कि एक भारी वाहक बाइंडिंग फेस को ढाल देता है या नहीं. समान पेलोड और समान लिंकर्स वाले दो संयुग्म पूरी तरह से गतिविधि में काफी भिन्न हो सकते हैं जहां से अनुलग्नक उतरा है.
असफलता कैसी दिखती है. उत्कृष्ट एक्सपोज़र और ख़राब क्षमता वाला एक संयुग्म, या एक संलयन जिसमें वाहक बाइंडिंग एपिटोप को स्टेरिकली ब्लॉक करता है. शुद्धता या सामूहिक जाँच में विफलता अक्सर अदृश्य होती है, क्योंकि अणु बिल्कुल वही है जो डिज़ाइन किया गया था - यह बस लक्ष्य को उसी तरह से संलग्न नहीं करता है.
इसे कैसे सत्यापित करें. विश्लेषणात्मक रूप से संयुग्मन स्थल और स्टोइकोमेट्री की पुष्टि करें, फिर असंयुग्मित पेप्टाइड से एक्सट्रपलेशन के बजाय संयुग्म के लिए बंधन और गतिविधि को मापें. जहां उद्देश्य एक विशिष्ट पेलोड ज्यामिति के बजाय आधा जीवन है, पेगीलेशन और आधा जीवन विस्तार रणनीतियाँ समान नियम का पालन करती हैं: विस्तार रसायन विज्ञान और अनुलग्नक बिंदु डिज़ाइन चर हैं, पैकेजिंग नहीं.
पाठ 4: पेप्टाइड फॉर्मूलेशन को डिज़ाइन का हिस्सा बनाएं, देर से किया गया बचाव नहीं
फॉर्मूलेशन वह है जहां आपके द्वारा स्थगित किए गए ट्रेडऑफ़ वापस आते हैं. अच्छी क्षमता और स्थिरता प्रोफ़ाइल वाला पेप्टाइड अभी भी घुलनशील होने पर भी विफल हो सकता है, एकत्रीकरण की प्रवृत्ति, या ऑक्सीकरण संवेदनशीलता केवल उस एकाग्रता और प्रस्तुति पर प्रासंगिक हो जाती है जिसकी प्रोग्राम को वास्तव में आवश्यकता होती है.
यह एक डिज़ाइन-स्टेज प्रश्न है, विकास-चरण वाला नहीं. वे गुण जो सूत्रीकरण व्यवहार को निर्धारित करते हैं - शुद्ध आवेश, हाइड्रोफोबिक वितरण, ऑक्सीकरण-प्रवण अवशेषों की उपस्थिति, उजागर हाइड्रोजन-बॉन्ड दाताओं की संख्या - आपके द्वारा चुने गए अनुक्रम द्वारा निर्धारित की जाती है. दो अन्यथा तुलनीय एनालॉग्स के बीच निर्णय लेना बहुत आसान होता है जब फॉर्मूलेशन की मजबूती शुरू से ही मानदंडों में से एक है.
सूत्रीकरण निर्णय स्वयं सुव्यवस्थित होते हैं. हाइड्रोफोबिक और इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन द्वारा संचालित एकत्रीकरण सर्फेक्टेंट चयन और पीएच अनुकूलन पर प्रतिक्रिया करता है. कम घुलनशीलता पीएच समायोजन पर प्रतिक्रिया करती है, सह-विलायक, या सूत्रीकरण सहायक पदार्थ. डीमिडेशन और आइसोमेराइजेशन द्वारा संचालित तटस्थ पीएच के आसपास अस्थिरता पीएच नियंत्रण पर प्रतिक्रिया करती है, और पीएच के नीचे लियोफिलाइज्ड भंडारण 6 ठोस अवस्था में डीमिडेशन को सीमित करता है. ऑक्सीकरण को हेडस्पेस नियंत्रण के माध्यम से प्रबंधित किया जाता है, अक्रिय-गैस प्रबंधन, एम्बर या डार्क भंडारण, और बार-बार शीशी खोलने से बचना.
जहां प्रशासन का रास्ता अभी भी खुला है, यह संपूर्ण अनुकूलन लक्ष्य - जीआई स्थिरता - को आकार देता है, रासायनिक संशोधन रणनीति, अशुद्धता प्रोफाइलिंग, और जैवविश्लेषणात्मक आवश्यकताएं स्वतंत्र रूप से होने के बजाय एक साथ बदलती हैं. वह युग्मन जल्दी मैप करने लायक है, क्योंकि प्रशासन का मार्ग पेप्टाइड विकास प्राथमिकताओं को कैसे नया आकार देता है यह बिल्कुल उसी प्रकार की बाधा है जो यह निर्धारित करती है कि सेट में कौन सा एनालॉग वास्तव में अग्रणी है.
असफलता कैसी दिखती है. प्रोग्राम क्षमता और स्थिरता के आधार पर लीड का चयन करता है, फिर सूत्रीकरण में पता चलता है कि अणु प्रयोग करने योग्य सांद्रता से ऊपर एकत्रित होता है, या कि इसके ऑक्सीकरण प्रोफाइल को प्रोग्राम के लिए आवश्यक कंटेनर में नियंत्रित नहीं किया जा सकता है.
इसे कैसे सत्यापित करें. स्क्रीन घुलनशीलता और एकत्रीकरण प्रारंभिक - पूर्ण लीड अनुकूलन से पहले - पीएच और सहायक स्थितियों में जो वास्तव में दायरे में हैं. फॉर्मूलेशन स्क्रीन एनालॉग सेट पर एक फिल्टर के रूप में अपस्ट्रीम से संबंधित है, बचाव के रूप में डाउनस्ट्रीम के बजाय जो भी उम्मीदवार पोटेंसी पर जीवित रहा, उस पर लागू किया गया.
पाठ 5: डिज़ाइन जोखिम के लिए विश्लेषणात्मक पुष्टिकरण का मिलान करें
विश्लेषणात्मक पुष्टिकरण रिलीज़ चेकबॉक्स नहीं है. यह वह तंत्र है जिसके द्वारा आप पता लगाते हैं कि आपने जो अणु डिज़ाइन किया है वह वही अणु है जो आपके पास है - और जितना अधिक आप अनुक्रम इंजीनियर करेंगे, कड़ी, या अनुवादोत्तर स्थिति, उतना ही अधिक उस प्रश्न को स्वतंत्र उत्तर की आवश्यकता होती है. विश्लेषणात्मक पुष्टि को अंतिम निरीक्षण के बजाय डिज़ाइन आउटपुट के रूप में मानना एक आशाजनक एनालॉग को गलत तरीके से पढ़े गए डेटा पैकेज पर उन्नत होने से रोकता है।.
ऑर्थोगोनल तरीके सफल होते हैं क्योंकि वे वास्तव में अलग-अलग सवालों के जवाब देते हैं. शुद्धता प्रतिशत पूछता है कि क्या नमूना एकल क्रोमैटोग्राफ़िक प्रजाति के रूप में व्यवहार करता है. यह नहीं पूछता कि द्रव्यमान क्या है, समाधान में किस आकार की प्रजातियाँ मौजूद हैं, या क्या ढांचा बच गया.
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विश्लेषणात्मक विधि |
प्रश्न यह उत्तर देता है |
यह जिन समस्याओं का पता लगाता है |
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आरपी-एचपीएलसी |
क्या यह एकल क्रोमैटोग्राफ़िक प्रजाति है?? |
पतित, काट-छाँट, ऑक्सीकरण और डीमिडेशन शिखर, बैच बहाव |
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LC-एमएस / एलसी-एमएस/एमएस |
क्या वह द्रव्यमान और अनुक्रम है जो डिज़ाइन किया गया था? |
विलोपन या विस्तार वेरिएंट, संशोधन-साइट असाइनमेंट, प्रोटियोलिसिस |
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एसईसी-एमएएलएस |
घोल में किस आकार की प्रजातियाँ मौजूद हैं? |
समुच्चय, oligomers, टुकड़े - प्रतिधारण-समय अनुमान के बजाय पूर्ण द्रव्यमान के साथ |
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सीडी |
क्या द्वितीयक संरचना अक्षुण्ण है?? |
हेलीसिटी हानि, β-शीट लाभ, एकत्रीकरण से जुड़ा खुलासा |
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एनएमआर |
क्या स्थानीय रासायनिक पर्यावरण संरक्षित है?? |
संरचनात्मक निष्ठा, आइसोमरों, सूक्ष्म संशोधन जो द्रव्यमान को थोड़ा स्थानांतरित करते हैं |
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एसपीआर / आईटीसी |
क्या बाइंडिंग कैनेटीक्स और थर्मोडायनामिक्स बरकरार हैं? |
आत्मीयता की हानि जिसे कोई भी शुद्धता परख नहीं देख सकता |
यहीं पर नियामक अपेक्षाएं अच्छे अभ्यास के साथ मिलती हैं. ईएमए सिंथेटिक पेप्टाइड्स के विकास और निर्माण पर दिशानिर्देश विनिर्देशन और रिलीज़ पर पेप्टाइड पहचान के लिए कम से कम दो ऑर्थोगोनल तरीकों का उपयोग करने की अनुशंसा करता है, चयनित संयोजन के साथ अनुक्रम की स्पष्ट रूप से पुष्टि करना आवश्यक है. मैं Q2(आर2) सत्यापन पक्ष से भी यही अपेक्षा की जाती है: किसी परिणाम की तुलना एक सेकंड से करके विशिष्टता प्रदर्शित की जा सकती है, एक अलग माप सिद्धांत पर आधारित सुव्यवस्थित प्रक्रिया.
व्यावहारिक नियम पुष्टिकरण पैकेज को डिज़ाइन जोखिम के अनुसार मापना है. एक अच्छी तरह से विशेषता वाले मचान में एक रूढ़िवादी एकल प्रतिस्थापन की कम आवश्यकता होती है; एक बहु-साइट संशोधन, एक चक्रीकरण, या संयुग्मन की अधिक आवश्यकता है. जहां एकत्रीकरण प्रशंसनीय है, बहु-कोण प्रकाश प्रकीर्णन के साथ आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी उच्च-आणविक-भार वाली प्रजातियों को विघटित करता है जिन्हें केवल शुद्धता मान ही विघटित अशुद्धता से अलग नहीं कर सकता है.
व्यवहार में यह कैसा दिखता है इसका एक कार्यकारी उदाहरण के रूप में, एमओएल परिवर्तन प्रकार का एक ऑर्थोगोनल पुष्टिकरण पैकेज प्रति लॉट आपूर्ति करता है - शुद्धता के लिए उलट-चरण एचपीएलसी, पहचान के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री, और एसईसी-एमएएलएस या एनएमआर जैसे पूरक तरीके जहां डिज़ाइन जोखिम उन्हें वारंट करता है, सारांश आंकड़ों के बजाय लॉट-विशिष्ट कच्चे क्रोमैटोग्राम और मास स्पेक्ट्रा द्वारा समर्थित - सबूत का एक रूप है जो प्रोग्राम को वास्तविक कारण के लिए बैच अंतर का श्रेय देता है. यह सबसे अधिक मायने रखता है जहां प्रोग्राम को अंततः बैच-टू-बैच स्थिरता का बचाव करने की आवश्यकता होगी: देखना एकल शुद्धता प्रतिशत से परे पेप्टाइड सूक्ष्म विषमता एक प्रतिशत-क्षेत्रफल का आंकड़ा आपको कितना बता सकता है और कितना नहीं.
असफलता कैसी दिखती है. एक शुद्धता का आंकड़ा जो स्वीकार्य दिखता है जबकि समाधान में वास्तविक प्रजाति एक समुच्चय है, एक डीमिडेशन वैरिएंट, या एक स्टीरियोकेमिकल आइसोमर. बैच रिलीज़ हो जाता है और परख खराब प्रदर्शन करती है.
इसे कैसे सत्यापित करें. डिज़ाइन जोखिम सूची से पुष्टिकरण पैकेज बनाएं: द्रव्यमान और अग्रानुक्रम द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पहचान और अनुक्रम, एक मान्य स्थिरता-संकेत क्रोमैटोग्राफ़िक विधि द्वारा शुद्धता और अवक्रमण, आकार-आधारित विधि द्वारा एकत्रीकरण, जब संरचना मायने रखती है तो सीडी या एनएमआर द्वारा संरचना, और बाइंडिंग या सेल-आधारित परख द्वारा कार्य करता है.
एक व्यावहारिक अनुकूलन अनुक्रम
उपरोक्त पाठ एक रेखीय योजना के बजाय एक दोहराव वाले लूप में सिमट जाते हैं.
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लक्ष्य प्रोफ़ाइल परिभाषित करें. संपत्ति लक्ष्य निर्धारित करें - सामर्थ्य, प्रोटीयोलाइटिक स्थिरता, घुलनशीलता, भेद्यता, एक्सपोज़र की अवधि - और संकेत और इच्छित मार्ग के लिए उनका वजन.
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फार्माकोफोर को ठीक करें. न्यूनतम सक्रिय मूल भाव को पहचानें और इसे एक बाधा के रूप में मानें, परिवर्तनशील नहीं.
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छोटा बनाओ, जिम्मेदार परिवर्तन. एक प्रतिस्थापन, एक लिंकर, एक बाधा, या प्रति एनालॉग एक अनुलग्नक साइट, इसलिए प्रभाव का पता लगाया जा सकता है.
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ट्राइएज जल्दी और समानांतर में. गतिविधि मापें, स्थिरता, घुलनशीलता, और पूर्ण अनुकूलन के बजाय पहले संश्लेषण दौर के तुरंत बाद एकत्रीकरण. किसी विफलता को जल्दी विकसित करना, फॉर्मूलेशन के समय उसका पता लगाने की तुलना में कहीं अधिक सस्ता है.
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ठीक करने से पहले निदान करें. क्लीयरेंस से रासायनिक क्षरण को भौतिक अस्थिरता से अलग करें, और वह लीवर चुनें जो प्रमुख मार्ग को संबोधित करता है.
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ऑर्थोगोनली पुष्टि करें. पुष्टिकरण पैकेज को डिज़ाइन जोखिम से मिलाएं और अणु की पहचान की पुष्टि करें, पवित्रता, आकार की स्थिति, और इसे आगे बढ़ाने से पहले संरचना. पेप्टाइड उत्पादन
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लूप को बंद करो. परिकल्पनाओं का एक नया सेट शुरू करने के बजाय मापे गए परिणामों को एनालॉग डिज़ाइन के अगले दौर में वापस फ़ीड करें. अनुक्रम अनुकूलन स्वभाव से पुनरावृत्तीय है; प्रत्येक दौर को डिज़ाइन स्थान को पुनः आरंभ करने के बजाय संकीर्ण करना चाहिए.
अक्सर पूछे जाने वाले प्रश्न
एक स्थिरीकरण प्रतिस्थापन पेप्टाइड गतिविधि को कम क्यों कर सकता है?? क्योंकि स्थिरता और कार्य अक्सर एक ही क्षेत्र द्वारा किए जाते हैं. FGF2 में S137P प्रतिस्थापन स्थानीय पैकिंग के माध्यम से β-हेयरपिन को मजबूत करके थर्मल स्थिरता बढ़ाता है, लेकिन रिसेप्टर-सामना वाली सतह पर पड़ने वाले प्रतिस्थापन बंधन ज्यामिति को बदल देते हैं. सबसे सुरक्षित नियम मचान को स्थिर करना और फार्माकोफोर को अछूता छोड़ना है, फिर कमरे के तापमान के बजाय तनाव में कार्य को फिर से मापें.
क्या एक शुद्धता प्रतिशत यह पुष्टि करने के लिए पर्याप्त है कि पेप्टाइड सही है? नहीं. एक एकल क्रोमैटोग्राफ़िक शुद्धता का आंकड़ा उत्तर देता है कि क्या नमूना परिस्थितियों के एक सेट के तहत एक प्रजाति के रूप में व्यवहार करता है - इससे अधिक कुछ नहीं. यह द्रव्यमान की पुष्टि नहीं करता है, क्रम, एकत्रीकरण स्थिति, या संरचना. ईएमए रिलीज के समय पहचान के लिए कम से कम दो ऑर्थोगोनल तरीकों की सिफारिश करता है, और डिज़ाइन जोखिम को यह निर्धारित करना चाहिए कि क्या आकार-आधारित या संरचनात्मक तरीकों की भी आवश्यकता है.
लीड ऑप्टिमाइज़ेशन के सापेक्ष फ़ॉर्मूलेशन कार्य कब प्रारंभ होना चाहिए? इससे पहले कि अधिकांश कार्यक्रम सोचते हैं. घुलनशीलता, एकत्रीकरण की प्रवृत्ति, ऑक्सीकरण संवेदनशीलता, और पीएच का प्रभाव अनुक्रम और संशोधन विकल्पों द्वारा निर्धारित किया जाता है, इसलिए वे उतने ही डिज़ाइन पैरामीटर हैं जितने वे विकास पैरामीटर हैं. पहले एनालॉग पैनल के साथ उनकी स्क्रीनिंग करने से ऐसे लीड का चयन करने से रोका जाता है जिसे प्रयोग करने योग्य एकाग्रता में तैयार नहीं किया जा सकता है.
अगले कदम
यदि आपके पास एक एनालॉग सेट है जो एक संपत्ति पर मजबूत और बाकी सभी जगह कमजोर दिखता है, उपयोगी बातचीत तकनीकी है: कौन सा पतन मार्ग हावी है, पुष्टिकरण पैकेज में क्या शामिल होना चाहिए, और क्या वर्तमान परख सेट माप विरूपण साक्ष्य से वास्तविक सुधार को अलग कर सकता है. अपने विशिष्ट अनुक्रम के विरुद्ध उस पर बात करना रक्षात्मक नेतृत्व के लिए सबसे तेज़ मार्ग है.
