He aha te tikanga o te Kete Immunopeptidomics Hou a Thermo Fisher mo nga Reremahi Peptide Ritenga
Ko te whenua o te rangahau whakaaturanga antigen me te kitenga neoantigen kei te haere i te huringa hangarau nui. Ko te hokohoko o te whakarite tauira paerewa me nga kete inenga kua whakaritea—te nuinga Thermo Fisher Scientific's SureQuant IP-MS tauira kete whakarite me nga punaha wehe a Pierce MHC Class I—kua kawea mai ano te whakaputanga o mua ki nga immunopeptidomics-a-a-a-a-a-a-a-a-ira..
I nga korero o mua, i whakawhirinaki nga immunopeptidomics ki te Raraunga-Tiaki Raraunga kaore i arohia (DDA) ki te kite i nga peptides MHC/HLA-whakaatu mai i nga lysates pūtau matatini. Ahakoa e whai hua ana mo te kitenga tuatahi, Ko nga rerengamahi DDA kaore i arohia i pa mai i te rereketanga o te rere-ki-whakahaere, iti te tairongo mo nga antigens iti-nui, me te pai o te whakatairite ki waenga taiwhanga.
Me nga kete paerewa, kei te tere te hurihanga o te ahumahi ki te inenga kua whakaritea—otira ko te Aroturuki Tauhohenga Whakarara o roto (IS-PRM) me nga rerengamahi kua whakaritea e SureQuant. Ko tenei kukuwhatanga tikanga ka whakahou ano i nga whakaritenga kua whakatakotoria ki runga i nga peptides waihanga tikanga whakarunga. Ko nga peptides tohutoro waihanga me te whakaingoa-i-tapanga (SIL) Ko nga paerewa o-roto ehara i te mea ko nga mana kounga anake; he reagents ine nui e whakahaere ana i te tairongo whakamatautau, awhe hihiri, me te tika spectrometric papatipu.
Ko te Huringa mai i te Whakakitenga ki te Inenga kua whakaritea i roto i te Immunopeptidomics
Ko nga kete kua oti te whakamaarama te whakamaarama i te whakarangatiratanga immunoaffinity ma te whakamahi i nga pirepire autō-a-mua kua whakamanahia., kua arotauhia nga lysis buffers, me nga kawa nakunaku microfluidic aunoa. Heoi ano, ka wetekina te mana tātari pono o enei kete ka honoa me te matakite papatipu kua whaaia i runga i nga irirangi papatipu Orbitrap taumira teitei.
Hopu Immunoaffinity <– MHC-I/II Antibody-Coupled Beads SIL Spike-In Standard <– Peptides Taumaha Hangarite Ritenga (AAA Kua Ine)
Reremahi Rerengamahi Immunopeptidomics Rererangi Putau / Te Tissue v v Waikawa Waikawa & Whakapaipai <– Wehenga o HLA Heavy Chains & Peptides v v Kua whakaritea nanoLC-MS/MS <– SureQuant IS-PRM / Orbitrap Whakatau teitei
I roto i nga whakamatautau IS-PRM kua whakaritea, peptides kua whakaingoatia kua whakaingoatia te taimana taumaha e rite ana ki nga neoantigens whakapaehia, ki nga antigens e pa ana ki te puku (Koia tena) ka werohia ki te tauira i mua i te tātaritanga LC-MS. Ka aro turukihia e te irirangi papatipu nga whakawhitinga katote mahanga mo nga peptide "marama" mutunga. (m/z marama) me te paerewa "taimaha" o roto (m/z taumaha).
Ka rite ki te whakaatu i nga tuhinga hou, penei a Te rangahau a PubMed mo te inenga peptide HLA e IS-PRM, ka tutuki tenei huarahi kua whakaritea ki te taumata attomole, te whakaahei i te whakamanatanga maia o nga riipene MHC iti-kape-tau ka ngaro i te tirotiro kore.
Taketake Matua: Ko te tangohanga o nga kete tauira tauira immunopeptidomics ka nekehia te mara mai i te tohu tohu ki te manatoko ine.. No reira, peptides tohutoro waihanga me tutuki matū tino, haupapa, me nga whakaritenga a-tinana hei karo i te whakararu i nga whakamatautau LC-MS kua whakaritea.
Whakatakotoranga Peptide whakarunga: He aha nga Kete Paerewa e hiahiatia ana
Ka whakauruhia e nga kairangahau nga kete immunopeptidomic kua whaaia ki roto i o raatau paipa, Me whakatikatika nga whakaritenga peptide ritenga whakarunga. Paerewa peptides waihanga mātauranga-kōeke (e.g., 70–80% te parakore me nga toenga porotiti) te whakauru i nga taonga tātari nui ki nga punaha nanoLC-MS/MS.
- Pānga Taurua Katote: Ko te TFA ka kaha te aukati tohu ESI i roto i te nanoLC-MS
- Gravimetric Defect: makuku + te whakauru mai o nga kaipatu 10-30% hapa taimaha
- Rongoā: 6M HCl ngaruiti hauwai + LC-MS AAA mo te ihirangi peptide kupenga
Nga Pou Kounga Peptide Ritenga Nui Glp 1 Kamupene Tripeptide
- Te matū & Pure Isotopic
- RP-HPLC Pure: >95% ki >98%
- Whakanui Isotopic: ≥99 ngota % 13C me 15N (C-terminal Lys/Arg)
- Trifluoroacetate (TFA) Tango Whakatau
- Whakatakotoranga: Te whakawhiti tote ki te Acetate/HCl Nga Peptides (TFA toenga < 1.0%)
- Te Inenga Tino ma te Taatari Waikawa Amino (AAA)
Ko te Whakanui Isotopic me nga Paepae Pure Isotopic
Mo nga whakamatautau IS-PRM me SureQuant i whaaia, whakauu-tapanga (SIL) Ko nga paerewa o roto ka whakahiatohia ma te whakauru i nga waikawa amino taumaha ki te C-terminus, te tikanga [^{13}C₆, ^{15}N₂]Raihina (Δ m = +8.0142 Na) ranei [^{13}C₆, ^{15}N₄]Arginine (Δ m = +10.0083 Na).
Hei whakapumau i te tika o te inenga:
- Pure Isotopic: Ko nga waikawa amino taumaha me whai ≥ 99 ngota % he ^{13}C me ^{15}N whakarangatira.
- Te Reiti Whakapainga Kore i Tapanga: Ko te pokenga peptide "maama" kore tapanga i roto i te paerewa taumaha me noho < 0.1%. Ko nga taumata teitei o te parakore marama e pupuhi ana i nga inenga peptide endogenous.
- Te Huringa Papatipu Tikanga: Ko te +8 Da ranei +10 Ko te huringa papatipu ka whakarite kia kaua e inaki te kopaki momotu mai i te paerewa taumaha ki te matapihi m/z monoisotopic o te tātari mutunga..
Tango Whakatau: Te whakaheke i te TFA Ion Suppression
I te wa o te Whakakotahitanga Peptide-Maro (SPSS), te wehenga mai i te kapia me te HPLC Whakamuri-Phase o muri mai (RP-HPLC) Ko te purenga ka whakawhirinaki nui ki te waikawa trifluoroacetic
Te Katote Hiko (ESI) Te pehi: CF_3COO^- Ko nga katote e hanga ana i nga takirua katote hau-waahanga kaha me te taketake pai H36 Peptide Wholesale toenga (Lys^+, Arg^+, me N-terminal NH_3^+), te whakakore i nga utu peptide me te tino whakaiti i te kaha o te katote.
ong>: CF_3COO^- Ko nga katote e hanga ana i nga takirua katote hau-waahanga kaha me nga toenga taketake pai (Lys^+, Arg^+, me N-terminal NH_3^+), te whakakore i nga utu peptide me te tino whakaiti i te kaha o te katote.
- Panuku Pupuri Chromatographic: Ko te TFA toenga ka mahi hei tauhohenga katote-taurua kaha hydrophobic, te whakarereke i nga wa pupuri chromatography wai rere nano, ka puta te hiku teitei.
⚠️ Whakatupato: Ma te whakamahi i nga peptides tohutoro waihanga kei roto te toenga TFA i roto i te nanoLC-MS/MS ka taea te pehi i te katote o nga peptides MHC iti-nui ki runga ki te 80%, ka arahi ki nga kino kino i roto i te whakamanatanga neoantigen.
Ko nga rerengamahi immunopeptidomic kua whakatauhia e whakahau ana i te tukanga whakawhiti parepare. Ma te huri i nga tote peptide mai i te trifluoroacetate ki te acetate (CH_3COO^-) hydrochloride ranei (Cl^-), ka whakahekehia te toenga TFA ihirangi ki < 1.0%, te whakarite i te whakautu tohu nanoESI.
Manatokonga Tino Whakaaetanga ma te Arotahi Waikawa Amino (AAA)
I roto i nga whakamatautau a SureQuant, Ko te tika o te inenga peptide endogenous he rite tonu ki te tika o te SIL kua werohia te kukū paerewa o roto..
Te whakawhirinaki ki te inenga papatipu gravimetric (te pauna lyophilized peptide paura) karekau i te tika na te rerekee o te wai (5–15 wt%) me te papatipu counterion toenga (10–25 wt%). He rite te taimaha o te ipu 1.0 mg o te paura peptide kei roto anake 0.70 mg o te peptide hohe kupenga.
Hei whakatutuki i te whakatikatika molar tika:
- Ngaruiti Waikawa Waikawa: Ko nga peptide ka hauwai ki roto 6 M HCl i te 110°C i raro ranei i te whakamahana ngaruiti mo te 1-2 haora.
- Wai Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS) AAA: Ko nga waikawa amino kore-waiwai ka tohua ki nga paerewa tohutoro tohutoro NIST, i tuhia ki roto a Journal of Proteome Research analysis on amino acid analysis for absolute peptide inenga.
- Ihirangi Peptide Net (NPC): Ko te molarity tika me te paheketanga NPC ka tuhia ki te Tiwhikete Tiwhikete (KoA), e taea ai te whakarite tika i te taumata-picomole ki roto.
Hurihuri Hiringa me nga Whakaritenga Whakataunga Whakanui-a-Tiki
Ko te whakamaoritanga haumanu o nga immunopeptidomics—penei i te whanaketanga o te kano kano mate pukupuku whaiaro me te whakamanatanga antigen therapy pūtau—e whakakaha ana i nga waa mahi.. Ko nga Kairangahau e whakamahi ana i nga papaa whakarite tauira aunoa kaore e taea te utu mo nga wa maha-marama mo nga peptides ritenga.
Te Tohu Whakaaetanga Immunopeptidomics Nui-Throughput Neoantigen Target Matapae → I roto i te Silico HLA Binding Algorithms Rapid Custom Synthesis → 10 – 14 Nga Ra Pakihi Tukatuka Whakarara → 96-Well Moroiti-Aliquoted Hōputu Arotautanga Mata Waka → Polypropylene Here-iti / LC-MS/MS Whakamātautau kua Whakarewa-mua → Whakamana Attomole mā SureQuant IS-PRM
Ko nga urutaunga whakahaere matua e whakaahuatia ana i a Kawa PMC mo te whakarite tauira immunopeptidomics whakauru:
- 10–14 Ra Tere-Tunahuri Synthesis: Ko nga papaaho SPPS whakarara aunoa ka taea te whakahiato 96 ki 384 peptides motuhake i te wa kotahi.
- 96-Kaati Pre
Kore-motuhake Adsorption Mitigation: Ko nga peptides herea ki te HLA he 8-11-mers te nuinga (Te akomanga I) ranei 12–25-mers (Class II) ka piri tonu ki nga papa kirihou paerewa. Ko te whakaheke moroiti ki roto i nga oko polypropylene iti herea, te tuku peptides ranei i roto i nga matrices DMSO/ACN kua memeha-mua ka aukati i te mate tauira hydrophobic. Te Kohanga Peptide
d nga papanga kirihou. Ko te whakaheke moroiti ki roto i nga oko polypropylene iti herea, te tuku peptides ranei i roto i nga matrices DMSO/ACN kua memeha-mua ka aukati i te mate tauira hydrophobic.
Whakaritenga Mahi mo nga Kaituku Peptide Ritenga
Hei awhina i nga kairangahau ki te tango i nga kete immunopeptidomic paerewa me te maia, Ko nga kaiwhakarato whakahiato peptide me huri mai i nga toa whakakao-whakaoti kia noho hei hoa otinga motuhake..
Whakaritenga Rautaki mo nga Kaiwhakarato Peptide Whakariterite 1: Nga Putumōhio Immunopeptidomics Kua Reri & Punga Whare Pukapuka
- Paewhiri tohutoro i mua-whakahiatohia mo nga alleles noa (HLA-A02:01, A24:02) Te urutau 2: Paewhiri QC kua whakaritea & Nga Tiwhikete Inenga-maha mo te Taatari
- ESI-HRMS tika papatipu (< 2 ppm), Nga tohu RP-HPLC, TFA toenga %, me te AAA Adaptation 3: Tapanga Tere & Ratonga Whakarereke Motuhake
- Te Kohanga Peptide Te kaporeihana isotope pumau, Nga tohu tohu-N/C, me te Karaehe 100 QC horomata
Nga Putumōhio Immunopeptidomics Kua Reri & Paewhiri Allele-motuhake
Me tuku e nga kaiwhakarato peptide he mea whakarite, nga panui tohutoro kei waho o te papa i runga i nga kaupapa punga allele HLA kua tohua.
- Nga Paewhiri o te akomanga I: Ko te uhi i nga alleles auau teitei penei i te HLA-A02:01, HLA-A24:02, HLA-B07:02, me HLA-C07:02. Kei roto i enei panui he nonamer kua whakamanahia ($9$-mer) me te decamer ($10$-mer) peptides me nga toenga punga kano (e.g., Leu/Met at Turanga 2 me Val/L-Leu i te Turanga 9 mo HLA-A*02:01).
- Paewhiri Class II: Hipoki HLA-DRB101:01, HLA-DRB104:01, me HLA-DQ8, te whakauru i nga raupapa 13-17-mer roa ake me nga ahuatanga whakarewatanga manatoko.
Kei te waatea nga panui o waho mo te tuku tere
Me tuku e nga kaiwhakarato nga CoA matawhānui kei roto: Kaiwhakarato Hauora Peptide
me te whakarite i te waa pupuri (e.g., te whakatikatika iRT) mo LC-MS rere.
Nga Paewhiri QC me nga Tiwhikete Matawhānui o te Tatari
He Mana Kounga pakari (QC) Ko te roopu mo nga peptides tohutoro immunopeptidomic me toro atu ki tua atu i te matakite papatipu MALDI-TOF.
Me tuku e nga kaiwhakarato nga CoA matawhānui kei roto:
- Taumira teitei ESI-HRMS Spectra: Manatokohia te papatipu monoisotopic me te ahua utu ([M+H]^+, [M+2H]^{2+}, [M+3H]^{3+}) me te hapa papatipu < 2 ppm.
- RP-HPLC Chromatograms: Te whakaatu >95% ranei >98% matū matū me ngā tikanga rōnaki mārama.
- Te Whakatau TFA toenga: Ion Chromatography (IC) te inenga 19F-NMR ranei e whakaatu ana i te toenga TFA < 1.0%.
- Ihirangi Peptide Net na AAA: Ko nga uara nanomoles/puu tika hei whakapumau i te reproducible i roto i te rei-in paerewa.
Mo te Aki: A, no te tono peptides SIL ritenga mo immunopeptidomics hāngai, whakarite i nga wa katoa ka tukuna e te kaihoko te ihirangi peptide kupenga kua whakamanahia e te AAA me te whakawhiti tote kore-TFA. Ko tenei taahiraa kotahi ka whakakore i te puna tuatahi o te rītaha ine i waenga i te puranga i roto i nga whakamatautau Orbitrap LC-MS..
Rapid Tapanga-Isotope Tapanga me nga Ratonga Micro-Aliquoting
Me whakatika nga kaiwhakarato i te whakahiatotanga o nga peptide kua whakarerekehia, tae atu ki:
- Ko te Kaporeihana Heavy Isotope Aunoa: He pai te hono o [^{13}C₆, ^{15}N₂]Lys me [^{13}C₆, ^{15}N₄]Arg kore waimeha isotopic i roto i te wehenga.
- tauranga & Nga Whakarereketanga o roto: Biotinylation, te whakakotahitanga fluorophore (e.g., FITC, Cy5), N-terminal acetylation, me nga ringaringa pawhiri-matū (azide/alkyne) mo te aroturuki antigen multi-modal.
- Te Tukatuka Whare Maamaa: Mo nga whakamatautau koiora o raro (e.g., Nga whakamatautau whakahohenga T-cell, ELISpot, he whakamatautau here TCR ranei), Ko nga peptides me tukatuka i raro i nga tikanga horoi horoi me te whakamatautau endotoxin (< 0.01 EU/µg).
Whakahoahoa Rautaki: Whakanuia nga Reremahi Immunopeptidomics
Ko te whakatere i nga uauatanga o nga immunopeptidomics e whaaia ana me whakarite tata ki waenga i nga kaihanga kete reagent, papatipu spectrometry whakaurunga matua, me nga hoa whakahiato peptide motuhake.
Hei kaiarahi i whakatapua ki te hanga peptide, te Ka Hurihia e te MOL te papahanga whakahiato peptide ritenga Ka whakarato i tetahi hanganga whakauru i hangaia hei tautoko i nga kaupapa immunopeptidomic matatau me nga kaupapa kitenga neoantigen.
Ka Hurihia e MOL Immunopeptidomics Engine
Ko te Whakawhitinga Tote SPPS Tote Raarangi AAA Ine i te akomanga 100 Whare horoi
→ Te whakahiatotanga o te Matatini & Hydrophobic Peptides → TFA Counterion Tangohanga (< 1.0% TFA toenga) → Ihirangi Peptide Net whaimana & Molarity Tika → Endotoxin-Free & Lyophilization mokorikori
Ma te whaihua Ko nga whakarereketanga peptide teitei me nga ratonga tango TFA, Ka taea e nga kairangahau te whakawhiti tika i te waahi i waenga i te whakarite tauira i runga i te kete me te inenga LC-MS e tino maia ana.. I tua atu, hanga i roto Karaehe horomata 100 hanga whare horoi Ko nga whakaurunga ka whakarite kia pai tonu nga paerewa peptide waihanga mo nga tirohanga e rua o te papatipu taiwhanga me te whakamanatanga mate-a-rorohiko..
Kua whakahurihia e nga kete tauira mo te whakatikatika i te tukatuka tauira immunopeptidomics. Ma te hono i enei kete me nga peptides waihanga ritenga i hangaia mo te maatanga isotopic tino, Ko te tango TFA, me te inenga AAA whaimana, Ka taea e nga kairangahau te whakatu i te pakari, nga paipa paipa teitei e akiaki ana i te kitenga neoantigen me te immunotherapy whakamua me te tino maia.
