I te wa e whakahuahia ana e nga Pepa nga Vectors Kaihoko: Me pehea te Panui Panui Reagent (Akoranga Take: GenScript pcDNA3 i MDM2 Rangahau)
I te wa e tirotirohia ana e nga kaitirotiro matua me nga kaiputaiao rangahau matua nga tuhinga hou i whakaputaina i roto i te oncology me te koiora pūtau, Ko nga korero a nga kaihoko ka kiia he tohu tohu whakaaetanga. Ma te kite i tetahi tohu tohu whakangote arumoni, peptide ritenga ranei e whakahuahia ana puta noa i nga pepa e rua tekau kua arotakehia e te hoa ka puta he whakaaro pono.. Mena he maha nga taiwhanga motuhake e hoko mai ana i tetahi hangahanga vector GenScript pcDNA3 motuhake, he peptide waihanga arumoni ranei hei ako i te tohu tohu MDM2-p53, he mea tika ki te tono i taua nama putumōhio rite tonu ka haere tika atu ki te mahi papa.
Heoi ano, Ko te mahi i nga korero a nga kaihoko hei takawaenga mo te kounga o te puranga whaimana ko tetahi o nga tino take o nga raraunga taiwhanga kore e taea te whakahoki.. Ko nga korero i roto i nga hautaka arotake-a-hoa e tuhi ana i nga whakamahinga o mua, ehara i te tinana motuhake, matū, manatoko mahi ranei. Ko nga tuara plasmid tauhokohoko ka tukuna nga huringa raupapa kaihoko, Ko te haere i roto i nga riipene kaihautu he whakauru i nga momo taupori iti, me nga mea kawe korero e peia ana e nga kaiwhakatairanga viral ka taea te mahi ohorere i runga i te papamuri ira pūkoro.
Ko te tiaki i te whakaputanga whakamatautau me ako me pehea te panui i nga tohutoro tuhinga me te mahi i tetahi kaupapa motuhake, mana kounga orthogonal (QC) kawa i mua i te tango i tetahi reagent e whakamahia ana i nga tuhinga.
Nga Tohunga Kaihoko Tauhokohoko vs. Takahanga Tautoko: Te Whakakore i nga Tohu Whakaaetanga Tika
Kia whai hua te arotake i nga rauemi i ahu mai i nga tuhinga, me wehe nga whare taiwhanga i nga tohu hokohoko rereke. I roto i te whakaputanga pūtaiao, te korero a te kaihoko, tohutoro pātengi raraunga, me nga kaitautoko huihuinga e mahi ana i nga mahi whakahaere me nga mahi whakatairanga, engari karekau tetahi o ratou e kii ana ka rite te mahi a te rota hou mai i te kaiwhakarato arumoni i roto i to whakamatautau.
Nga Tuhituhi / RRID → Tuhinga o mua (Te wahi i hokona ai)
Kaihoko Kaihoko → Tohu Tauhokohoko Tauhokohoko (Tirohanga waitohu)
QC Orthogonal & CoA → Manatoko Manawa (Te tuakiri rota-motuhake & mā)
Nga Tirohanga Tuhituhi me nga Kaitohu Rauemi Rangahau (Nga RRID)
Ina whakarārangihia e te pepa he nama putumōhio, Kaitohu Rauemi Rangahau ranei (HE hiahia ahau), ka whakatauhia te tohu mo nga raraunga kua whakaputaina. Ko nga mahi whakahua i te paerewa e whakatairanga ana i te manatokotanga me te whakaputa mai i nga tikanga ma te tuku i nga kaipanui ki te whai i nga takenga rauemi puta noa i nga rangahau., kua tohua ki roto He aratohu whakaputanga a NIH mo te manatoko me nga korero korero.
Ko nga papahanga maina kupu penei i a CiteAb ka whakahiato i enei korero ki te ine i te tango i te maakete me nga tikanga whakamahi, whakarato i te matauranga nui ki te aroaro o te kaihoko, kua whakahuahuatia i roto Ko te tātaritanga whakahuatanga hua putaiao ora a CiteAb. Te whakahua i nga nama putumōhio hua, tau rota, me nga RRID ka whakarite ka taea e nga hoa putaiao te tautuhi i nga rawa o raro, i whakaahuatia i roto i Ko te aratohu a StressMarq mo nga korero hua RRID.
Heoi ano, ka tuhia e te tuhinga korero nga mea i hokona e te roopu rangahau o mua-kaore i te whakapumau i whakamanahia te reagent i mua i te whakaputanga o a raatau whakamatautau.
Taketake Matua: Ko te korero i arotakehia e te hoa e whakau ana i whakamahia tetahi rauemi kaihoko motuhake i roto i tetahi rangahau kua whakaputaina, engari karekau e whakakapi i te tinana motuhake, raupapa, manatoko mahi ranei i roto i to ake taiwhanga.
Tautoko Tauhokohoko Tauhokohoko me te Tirohanga Waitohu
Nga kaupapa tautoko—pēnei i nga tihokahoka o nga kaihoko i nga huihuinga matua, awheawhe hangarau tautoko, he putea haerenga putaiao ranei—he mahi hei tohu tirohanga arumoni. Ko te tautoko e whakaatu ana i te kaha hokohoko o te kaihoko, ehara i te maatanga tātaritanga, te pono mahi ranei o o ratou reagents koiora.
Ko te ti'aturi ki te rongonui o te waitohu kaihoko, ki nga korero tuhi maha ranei hei whakakapi mo te mana o te kounga o roto ka nui te mate koiora., otira ki nga huarahi ture tairongo penei i te tohu MDM2/p53.
Akoranga Take: GenScript pcDNA3 Whakaaturanga Hanga i roto i te MDM2/p53 Rangahau Tohu
Kia mohio ai koe me pehea e taea ai e nga vector tohu-pukapuka te whakauru i te rereketanga whakamatautau, whakaarohia te whakamahinga o nga hanga korero GenScript pcDNA3 i roto i te rangahau MDM2.
Kiore meneti rua 2 (MDM2) Ko te E3 ubiquitin ligase e mahi ana hei kaiwhakahaere kino tuatahi o te p53 pukupuku suppressor pūmua.. I roto i nga punaha p53 momo mohoao, Ka herea e te MDM2 te rohe whakawhiti N-terminal o p53, e whaaia ana mo te paheketanga proteasomal i roto i te kapiti urupare-kore-kore, rite taipitopito i roto i he arotake matawhānui i roto i te Hoahoa Rongoa o Naianei. No te mea ka taea e MDM2 overexpression te pehi i te mahi p53 me te kore he ira ira tika, He maha nga wa ka whakawhitihia e nga kairangahau nga plasmids MDM2 recombinant ki te arotake i te hopu huringa pūtau, apoptosis, iti-ngotaota MDM2-p53 aukati ranei.
pcDNA3 Whakaaturanga Vector Backbone CMV Kaiwhakatairanga → Epitope Tag → MDM2 Whakauru → BGH PolyA (I pehia e p53) (Ka taea te whakarereke i te E3) (Rohe RING) (Pumautanga tuhinga)
Ko nga Plasmids penei i te pcDNA3 MDM2 WT he maha nga raarangi i roto i nga whare putunga matauranga, tae atu ki te Addgene pcDNA3 MDM2 WT pātengi raraunga, ka whakahiatotia, ka whakarereketia ranei e nga kaihoko hokohoko penei i a GenScript. Ko te tuara vector pcDNA3 (5.4 kb) ka whakamahi i te cytomegalovirus tangata (CMV) kaiwhakatairanga moata-moata mo te whakaaturanga whakangote taumata tiketike, he takenga SV40 mo te tukurua episomal i roto i te SV40 nui T-antigen e whakaatu ana i nga pūtau manaaki (penei HEK293T), me te tohu tohu neomycin/G418.
Taonga Whakamatau 1: Whakatairanga Whakatairanga CMV na te Momo Mohoao p53
Ko tetahi raru nui i roto i nga rangahau korero MDM2 ko te ture whakatairanga. Ahakoa ko te kaiwhakatairanga CMV i roto i te pcDNA3 e kiia ana he kaiwhakatairanga kaupapa kaha, Ko nga rangahau rangahau e whakaatu ana ko te mahi kaiwhakatairanga CMV kei te kaha te pehia e nga taumata p53 momo mohoao teitei., i whakaaturia i roto he rangahau i whakaputaina i roto i te Journal of Biological Chemistry. Rasa Rangahau Peptides Kaiwhakarato
I te wa e whakawhitihia ana e nga kairangahau te pcDNA3-MDM2 ki roto i nga ruma me te tohu p53 mau tonu, te piki ake o nga taumata p53 ka pehi i te kaiwhakatairanga CMV, ka puta ko te aho-kore, whakawhäiti MDM2 whakaaturanga. Mena ka mau tetahi roopu rangahau i nga mahi kaiwhakatairanga i nga wa katoa i runga i nga tuhinga korero, Ko nga huringa i roto i te nui o te pūmua MDM2 ka pohehe pea ki te whakamatautau i te kaha o te puhui, te whakaheke ranei i muri i te whakamaoritanga, kaua ki te whakakore i te kaiwhakatairanga..
Tuhi Take Take (Ka Hurihia e MOL te Taiwhanga Mana Kounga): I roto i te whakamana-whakawhitinga orthogonal o nga hangahanga pcDNA3 plasmid tuhinga-puna, Ko te raupapatanga Sanger-rua puta noa i nga hononga-whakatairanga-whakauru i kitea nga momo rereke-nucleotide kotahi kaore ano kia maheretia (Nga SNV) i roto i te rohe kaiwhakatairanga moata-moata o te CMV. Ko enei huringa raupapa iti i hua ake he ~35% te whakahekenga o nga mahi kaiwhakatairanga turanga i roto i nga tauira momo mohoao ka whakatauritea ki nga mapi tohutoro NCBI canonical—e whakaatu ana he aha te take e whakahauhia ai te manatoko raupapa ira i mua i te whakahaerenga o nga whakamatautau pūkoro whakararo..
Taonga Whakamatau 2: Tohua Epitope me nga Huringa Rohe RING-Mamati
Ki te whai i te recombinant MDM2, He maha nga wa ka apitihia e nga vectors arumoni nga tohu tohu epitope N-terminal, C-terminal epitope (penei i a Myc, haki, GFP ranei). Ka whakawhirinaki a MDM2 ki tana rohe C-terminal RING-finger mo te mahi E3 ubiquitin ligase me te homodimerization. Peptides Stapled
Mēnā ka whakarerekēhia e tētahi kaihoko arumoni te hononga kati, ki te whakauruhia he tohu ki te taha o te rohe maihao-RING me te kore e whakamanahia te hanganga., ka whakaatu pea te pūmua hanumi kua heke te mahi ligase E3, kua whakarereketia ranei te motuhake o te tïpako. Ko te raupapa Sanger o nga hononga whakaurunga me te hiranga papatipu orthogonal e tika ana hei whakapumau kaore te tohu i whakararu i te whakakopa rohe mahi..
Ko Nga Morearea Huna o nga Reagents Whakamahinga Tuhituhi: Raupapa Panuku, Tauwaenga Tohu, me te Rerekēnga Puranga
Ko te tango i nga reagents kua whakahuahia i nga tuhinga me te kore manatoko ka whakaurua e toru nga tikanga rahunga hangarau nui:
- Nga Ikenga Kore Maherea me te Raupapa Whakaheke: Ka taea e nga plasmid te whakatipuria puta noa i nga riaka huakita o te kaihautu te whakaemi i nga huringa ira, whakaurunga, huānga whakawhiti ranei. Ko te whakawhiti i nga whakaritenga plasmid me te kore e raupapa i nga rohe whakauru ka taea te whakarereke i te kaha o te kaiwhakatairanga, te whakauru ranei i nga whakarereketanga wahangu / ngaro i roto i te anga tohu..
- Peptide me te Reagent Parakore: I roto i te whakahiato peptide (penei i te MDM2-binding helical peptides ranei p53-ahua tracer peptides), Ka taea e nga kaiwhakarato arumoni te tuku rauemi kei roto nga raupapa mukunga kua tapatapahia ((n-1) ranei (n-2) ngohe) ki te kore e tika te purenga. Ka taea e nga peptides waihanga kore i purea te hanga i nga kinetics here-pai i roto i te resonance plasmon mata (SPR) polarization fluorescence ranei (FP) whakamātautau.
- Ko nga Rerekēnga CoA me te Roa Tauiwi: Tiwhikete Tiwhikete (CoAs) ka whakaratohia e nga kaiwhakarato ka tohu pea i nga whakamatautau puranga o mua, kaua ki te ipu motuhake ka tukuna ki to taiwhanga. Ki te kore e whakamanahia te whai waahi me te whakamatautau i te pumau o te rokiroki, Ka taea e nga rereketanga o te maa-ma-roto te whakararu i te reproducibility ine.
Mo te Aki: Kaua rawa e whakaaro ko te Tiwhikete Taatari arumoni e whakaatu ana i te ahua tinana o naianei o te reagent i muri i te whakawhiti. Me whakahaere i nga wa katoa he haki tuakiri me te maatanga o roto ina tae mai.
Ko te Kawa Whakamana Motuhake 3-Waahi mo nga Reagents Putake-Literature
Hei tiaki i nga kaupapa rangahau mai i nga taonga reagent kore manatoko, me whakatu e nga taiwhanga he paerewa, toru-waahi rerengamahi whakamana orthogonal.
Tauranga 1: Te Tari Arotake → Te Waahanga 2: Raupapa & QC a tinana → Tauranga 3: Mana Mahi
(KoA & Kei te pirangi ahau ki te tirotiro) (Kaiwaiata/NGS & RP-HPLC/MS) (p53-null & Nga Whakamatau Proteasome)
Tauranga 1: Te Taatari Raina me te Aroturuki Rota
I mua i te wetewete, te whakawhiti ranei i tetahi hanga vector hou, peptide waihanga ranei, manatoko ona tuhinga katoa:
- Raraunga Raraunga Raraunga Tuhia: Tuhia te ingoa kaihoko, tau putumōhio tika, karaka ID, tau puranga / rota, me RRID.
- Ka tirohia te Mahere Kaihoko me te CoA: Whakatauritehia te mahere plasmid i tukuna mai e te kaihoko ranei
Nga Peptides Whakaritehia te Raina Whakatio: Mo nga plasmids, whai i te riaka huakita kaihautu, te kukū whiriwhiri paturopi, me te tau irava mai i te huringa tuatahi.
te kukū whiriwhiri paturopi, me te tau irava mai i te huringa tuatahi.
Tauranga 2: Raupapa Orthogonal me te Whakaaturanga Tinana
Me whakahaere te whakamana a tinana me te ira i mua i te whakahaere i nga whakamatautau koiora:
- Whakaraupapa Sanger: Mahia te raupapatanga Sanger-rua puta noa i nga hononga-whakatairanga-whakauru katoa, nga tohu epitope, me nga waahi whakarereke i hangaia.
- Whakapapa-whakatupuranga (NGS): Mo te matatini, roa, he vectors maha-cistronic ranei, whakamahia te raupapa panui-roa (penei ko Oxford Nanopore ko PacBio ranei) ki te kite i nga momo ahua iti-auau, i nga whakarereketanga tuara ranei ka ngaro pea te raupapatanga a Sanger.
- RP-HPLC me te Mass Spectrometry (MS) mo nga Peptides: A, no te whakamahi tauhohenga peptide waihanga, tātarihia te tauira ma te whakamahi i te C18 Reverse-Phase HPLC (0.1% TFA i te rōnaki H₂O/ACN) ki te whakarite taumira teitei (Rₛ ≥ 1.5) me te ma (≥ 98%). Whakapumautia te taumaha ngota ma te whakamahi High-Resolution Electrospray Ionization Mass Spectrometry (ESI-MS) me te hapa papatipu i raro 5 ppm.
Mo nga taiwhanga e rapu ana i te whakahiato ritenga me te manatoko, te whakamahi a tūāpapa whakahiato peptide ritenga tautokona e te matawhānui HPLC tātari me nga ratonga whakamatautau spectrometry papatipu ka whakapumau i nga raupapatanga katoa ka tukuna he tohu tino kaha i mua i te whakamahi.
Tauranga 3: Mana Ara Mahi
Ko te whakamanatanga koiora e whakau ana ka tika te mahi o te pūmua kua whakahiatotia, te peptide whakahiato ranei i roto i te horopaki pūtau i whäia.:
- Whakaaturanga me te Rahi Manatoko: Mahia te wetewete o te Tai Hauauru, te tātari immunoprecipitation ranei hei whakaū i te rite o te hangahanga ki te taumaha ngota i matapaehia me te kore hua o te whakahekenga ohorere..
- Whakahaerenga Papamuri Ira Putau: I te wa e arotake ana i nga hanganga MDM2, whakaurua nga raina pūtau p53-null (penei i a Saos-2, H1299 ranei) i te taha o nga raina p53-wildtype (penei MCF-7, U2OS ranei) ki te wehewehe i te paitini e whakawhirinaki ana ki te p53 mai i nga paanga vector kore-whaainga.
- Nga Whakamatau Whakatau Proteasome: Whakapaia nga pūtau kua whakawhitia me te aukati proteasome (penei MG132) ki te whakaū ka taea te whakaora i te MDM2-mediated p53 degradation, te whakarite i nga mahi ligase E3 mahi.
Anga Ripanga: Te Rarangi Arowhai Taiwhanga mo te Whakamana me te Tukurua
Ko te rarangi arowhai arotake e whai ake nei he anga anga mo
Whakamana wheketere Kamupene Peptide Whakapono Tauranga
i whakahuahia nga vectors me nga reagents peptide ritenga i mua i te mahi whakamatautau:
| Wāhanga Whakamana | Tawhā / Whakamatau | Paearu Whakaaetanga | Te Taonga Tuatahi i aukatihia |
|---|---|---|---|
| Tauranga 1: Te whakapapa | Te Aroturuki Rota & CoA Audit | Tau puranga taurite
Liraglutide Api Kaihanga Kaihanga 100% te tuakiri raupapa puta noa i te kaiwhakatairanga, tūtohu, me te whakauru i nga rohe > Te hoko i nga momo ahua plasmid hē, i nga taonga putumōhio whakarereke ranei |
|
| Tauranga 2: Raupapa | Kaihanga / NGS Junction Sequencing | 100% te tuakiri raupapa puta noa i te kaiwhakatairanga, tūtohu, me te whakauru i nga rohe | Nga huringa anga-neke, ira ira, me nga whakakorenga hononga |
| Tauranga 2: QC tinana | RP-HPLC Purity Analysis | Kotahi te tihi chromatographic koi, mā ≥ 98%, Rₛ ≥ 1.5 | Nga raupapa mukunga kua tapahia (n-1) me te whakahiato i nga hua taha |
| Tauranga 2: Mass QC | ESI-MS Whakatau teitei Te Kohanga Peptide | Monoisotopic papatipu tika i roto < 5 ppm o te papatipu ariā | Ko nga whakakapinga waikawa amino he he, he whakakorenga kore ranei |
| Tauranga 3: Mahi | Puta Uru & Whakaaturanga Manatoko | Ko te roopu taumaha irapoi tika; kaore he hua pakaru ohorere | Te pohehe o te pūmua, te whakaheke tere, he kore korero wahangu ranei |
| Tauranga 3: Huarahi | Isogenic & Mana Pūtau Kore | Maamaa te rereketanga mahi i roto i te p53-wildtype vs. p53-null pūtau | Ko te tukunga teka o te paitini vector ki te tohu ara motuhake |
Te Tiaki i te Whakaaturanga Whakamatau i te Ritenga Vector me te Peptide R&D
Ko nga tuhinga tuhi hei timatanga mo te kowhiringa reagent, engari kaore e taea e raatau te whakakapi mo te mana kounga o roto. I te mea kei te anga whakamua te rangahau rongoakoiora mo te whakahokinga raraunga, Ko nga taiwhanga e whakamana takitahi ana i ia hanga vector me te puranga peptide e tiaki ana i a raatau putea putea, aukati i nga haora rangahau moumou, me te whakarite kia mau tonu nga whakatau kua whakaputaina.
I te wa e rapu ana i nga rawa motuhake, i te whakanui ranei i nga raupapa ritenga, mahi tahi me tetahi hoa tātari e whakahaere ana i roto Karaehe 100 nga whare horoi horoi ka whakarite kia whakakorehia te whakawhitinga-whakawhitinga me nga endotoxins taiao mai i te hanga. I tua atu, whaihua rongoā CRO peptide motuhake ka taea e nga roopu rangahau te whiwhi i nga rawa kua tuhia katoa—e tautokona ana e nga chromatograms HPLC takitahi, ESI-MS hiranga, me nga CoA tino-motuhake—i mua i te tiimata i nga whakamatautau pūtau tino nui.
Ma te whakakotahi i te tātaritanga tuhinga whakahirahira me te kawa whakamana 3-waahi, Ka taea e nga taiwhanga rangahau te whakamahi i nga taputapu kua whakahuahia i roto i nga tuhinga me te tiaki i te pono me te whakahoki ano i o raatau putanga putaiao..
Nga Mahi Panuku mo R&D Kapa
Me whai tohu motuhake me te whakahiato peptide ritenga tino parakore mo to paipa rangahau? Whakapa atu ki nga tohunga tātari i MOL Changes ki te tono i tetahi arotakenga hangarau, arotake tawhā whakamātautau tātari, te torotoro ranei i nga otinga whakahiato ritenga e whakangao ana ki o whakaritenga whakamatautau.
Mo nga Kaiarotake Putaiao
Ko tenei aratohu hangarau i tuhia, i arotakehia e te MOL Hurihia te Poari Tohutohu Putaiao & Rōpū Rangahau—he roopu whakauru o nga tohunga kemu peptide matua, tohunga koiora, me nga tohunga QC tātari. Mahi i roto i te Karaehe 100 nga whare horoi horoi, ko te roopu MOL Changes he tohungatanga ki te hoahoa raupapa peptide ritenga, te whakahiato moroiti/waa totoka, me te whakamanatanga tātaritanga motuhake mo te rota (RP-HPLC, ESI-MS, me te whakamatautau mo te mate) ki te tautoko i te rangahau putaiao ka taea te whakaputa.
