Bibliotecas de peptídeos derivados de proteoma para perfil de especificidade profunda de reagentes de modificação N-terminal

Os terminais N de proteínas e peptídeos são alvos importantes para modificação seletiva com reagentes quimioproteômicos e ferramentas de bioconjugação. A α-amina N-terminal ocorre apenas uma vez em cada cadeia polipeptídica, tornando-o um alvo atraente para bioconjugação de proteínas. Nas células, novos terminais N podem ser gerados por clivagem proteolítica e capturados por reagentes de modificação do terminal N que permitem a identificação de substratos de protease em todo o proteoma com espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS). Uma compreensão da especificidade da sequência N-terminal dos reagentes de modificação é crítica para cada uma dessas aplicações. Bibliotecas de peptídeos derivados de proteoma em combinação com LC-MS/MS são ferramentas poderosas para traçar o perfil da especificidade de sequência de reagentes de modificação N-terminal. Essas bibliotecas são altamente diversas, e LC-MS/MS permite a análise das eficiências de modificação de dezenas de milhares de sequências em um único experimento. Bibliotecas de peptídeos derivados de proteoma são uma ferramenta poderosa para traçar o perfil das especificidades de sequência de reagentes de marcação de peptídeos enzimáticos e químicos. Subtiligase e 2-piridinocarboxaldeído (2PCA) são dois reagentes que foram desenvolvidos para modificação seletiva de peptídeos N-terminais e podem ser estudados usando bibliotecas de peptídeos derivados de proteoma. Este protocolo descreve as etapas para gerar bibliotecas de peptídeos derivados de proteoma diversos no terminal N e para aplicar essas bibliotecas para traçar o perfil da especificidade dos reagentes de modificação do terminal N. Detalhamos as etapas para traçar o perfil da especificidade do 2-piridinocarboxaldeído, um reagente de modificação química, e subtiligase, um reagente de modificação enzimática. Esses protocolos podem ser facilmente adaptados a fontes alternativas de proteoma e outros reagentes de marcação de peptídeos N-terminais.