Bozunma Tarama Reaktifinin Aslında Ne Yapması Gerekir?
Kalite Kontrol'ü değerlendirmeden önce, ilgili reaktif sınıflarının ayrılmasına yardımcı olur. Standart proteomik ve kimyasal prob kılavuzları, floresan raporlayıcıları diğerlerinden ayırır, aktivite bazlı problar, ve afinite zenginleştirme reaktifleri, her bir dönüştürücü ubikuitin-proteazom sistemi (GÜÇ KAYNAĞI) aktiviteyi hücrelerde ölçülebilir bir okumaya dönüştürmek, lizatlar, veya hücre içermeyen reaksiyonlar.
-
Floresan etiketler Aktif enzimleri görselleştirmenize veya ölçmenize olanak tanır, proteazom alt birimleri, veya raportör substratları jel içi floresansla, mikroskopi, veya sinyal kazancı/kaybı muhabirleri.
-
Biyotin etiketleri zenginleştirme araçlarıdır, aktif deubikuitinazların yakalanması (DUB'lar) veya immünoblotlama veya kütle spektrometresi tanımlamasından önce streptavidin aşağı çekilmesiyle değiştirilmiş proteinler.
-
Ubiquitin ve NEDD8-mimetik problar ve florojenik veya FRET substratları, ubikuitini ubikuitin benzeri değiştiricilerden ayırması gereken enzimleri ve ligazları sorgular; bu, hedeflenen bir bozunma olayının gerçekten gerçekleşip gerçekleşmediğine karar veren kimyadır..
-
Bozunma yüzeyleri Bileşik kaynaklı veya proteozom bağımlı bir kaybın ölçülebilir bir sinyal değişikliği üretmesini sağlayacak şekilde istikrarsızlaştırıcı veya degron bir dizi taşır.
Bu rollerin her biri küçük bir yapısal detay üzerinde işlem yapıyor: hangi kalıntı etiketlendi, bir değişikliğin bulunduğu yer, bir izopeptit veya oksiester bağlantısının doğru olup olmadığı, ve savaş başlığının doğru terminalde bulunup bulunmadığı. A reagent whose “95% purity” hides a dominant des-amidated or deletion isomer can change binding, istikrar, veya tüm ekranın yorumunu yeniden şekillendirmeye yetecek kadar görünür bozulma oranı.
Etiketli Peptitler Etikete Özel Onay Gerektirir
Floresan veya biyotin etiketi pasif bir eklenti değildir. Konjugasyon, kromatografide hem alıkonma süresini hem de iyonizasyonu değiştirir, ve öngörülebilir bir kütle değişimine neden olur - ancak yalnızca amaçlanan türün oluşan tür olması durumunda.
Burada reaktif kalitesi, etiketli türler, sadece ana peptid değil. Bu genellikle gerektirir:
-
Peptit Sentezi beklenen kütle kayması yoluyla eklenen etiketin kütle spektrometresi doğrulaması;
-
LC-MS veya UPLC, etiketli molekülün tanımlandığı gibi ayrıştığını ve iyonize olduğunu doğrulamak için kontrol eder, Baskın türler;
-
etiket için ayrı kimlik raporlaması, çünkü değiştirilmiş davranışı birlikte elüsyon yapan yan ürünleri maskeleyebilir.
Biyotin için, mesele zenginleştirme aslına uygunluğu: kısmen etiketlenmiş veya yanlış biyotinlenmiş bir parti, streptavidin'i farklı şekilde bağlayabilir ve yanlış protein setini aşağı çekebilir. Floroforlar için, başarısızlık modu farklıdır ancak aynı derecede yıkıcıdır; test dalga boyunda otomatik olarak floresans oluşturan bir safsızlık, gerçek sinyali taklit eder ve isabet oranlarını artırır. Tarama laboratuvarları, satıcılardan giderek daha fazla kesin etiketli kütleyi ve son konjugatın kromatogramını bildirmelerini istiyor, yalnızca dizi saflığı değil.
Teste Özel Değişiklikler Doğrulanmalıdır, Varsayılan Değil
Bozunma reaktifleri sıklıkla düz peptidler değildir. Ubikitin-mimetik veya NEDD8-mimetik elementler taşırlar, elektrofilik savaş başlıkları, yakın ilgi kolları, bağlayıcılar, ve FRET veya florojenik çiftler. Kanıt yükü, bunu doğrulamaktır. amaçlanan yapı partiye hakimdir ve istenmeyen izomer yoktur, kesme, veya yan ürün testi bozacak düzeyde birikmiştir.
Parçalayıcıların küçük moleküllü tarafı için, analitik uygulama zaten açıktır: sağlam bir paket, organik saflık için LC-MS veya HPLC kullanır, Yapı ve kütle dengesi için NMR veya qNMR, ve çinko koordinasyonunu giderebilecek stereomerkez epimerizasyonunu ve eser metal kirleticilerini yakalamak için sıklıkla kiral veya metal analizi. Aynı taramaları besleyen peptid ve protein reaktifleri aynı disiplini hak ediyor: modifikasyon bölgesinin doğrulanması, bağlantı ve terminallerin doğrulanması, ve baskın safsızlığın biyolojik okumaya müdahale edip edemeyeceğine dair netlik.
Dizinin Aslına Uygunluğu Tartışılamaz
Tarama kütüphaneleri ve prob setleri genellikle bir degronu kodlayan tanımlanmış bir birincil yapıya göre sıralanır., tanıma motifi, bir enzim kesim bölgesi, veya fosforilasyona bağlı bir sinyal. Dizi sadakati, yapının silinmeden gerçekte gönderilen şey olduğu anlamına gelir, oyuncu değişikliği yok, yanlış birleşme yok, ve N'yi düzeltin- ve C-termini.
Aslına uygunluk, araştırma düzeyindeki kısayolların en sık ortaya çıktığı yerdir. Yalnızca sağlam kütleyi doğrulayan bir satıcı, aynı nominal kütleye sahip bir silinme izomerini gözden kaçırabilir, veya yanlış kalıntıya kurulmuş bir fosfo-bölgesi. Dizi düzeyinde güven, peptit haritalaması veya MS/MS parçalanmasını gerektirir, kompozisyon için amino asit analizi, ve - yoğun şekilde değiştirilmiş yapılar için - kurulu her grubun amaçlanan alanda bulunduğunun doğrulanması. Başarısız bir bozundurucu taraması veya kafa karıştırıcı bir DUB sonucu "substrat dizisinin bir kalıntı kadar hatalı olduğunu" gösterdiğinde," Bunun maliyeti, hiçbir alt yazılımın düzeltemeyeceği haftalarca tekrarlanamayan verilerdir.
Ortogonal Analitik Doğrulama Güveni Artırıyor
Tek bir analitik sinyal nadiren kimliği belirler. Avrupa İlaç Ajansı rehberliği gelişim Sentetik Peptitler ve sentetik peptidlerin üretimi, tanımlama için en az iki ortogonal yöntemi önerir, ve ortogonal boyut-, şarj-, saflık karakterizasyonu için hidrofobiklik temelli yaklaşımlar.
Ortogonal doğrulama, etiketli ve değiştirilmiş reaktifler için basit doğrusal peptitlerden daha önemlidir, çünkü hiçbir kromatografik yöntem her safsızlık ailesini çözemez. Karmaşık bir tarama yapısını kontrol eden bir kimyager, tipik olarak ters fazlı HPLC'yi ikinci bir sütun kimyasıyla eşleştirecektir., kütle doğrulamasını MS/MS veya peptid haritalamayla birleştirin, ve stereokimyasal bütünlük için kiral ayırma veya toplanma durumu için çok açılı ışık saçılımı ile boyut dışlama gibi hedefe yönelik yöntemler ekleyin. Reaktif kantitatif bir okumayı beslediğinde, Bu katmanlı kanıt, kimlik ve saflık iddialarının tek bir tepe alan yüzdesi değil, gerçek ve tekrarlanabilir olduğuna güvenmenizi sağlar..
Kütüphanelerin Toplu Tutarlılığa Göre Yaşanması veya Ölmesinin İncelenmesi
Tarama kütüphaneleri birçok kuyudan inşa edilmiştir, birçok şişe, ve - önceden plan yapmadığınız sürece - birçok üretim partisi. Partiden partiye değişkenlik, uzunlamasına eleklerin sessiz katilidir, çünkü küçük bir safsızlıktaki sürüklenme veya kromatografik parmak izindeki kayma, her parti nominal olarak kendi saflık spesifikasyonunu geçse bile test davranışını değiştirir.
Tutarlılık disiplininin üç bileşeni vardır:
-
Parti izlenebilirliği — her flakon veya kütüphane plakası, kesin bir seri tanımlayıcıya ve seriye özel bir analiz sertifikasına bağlanır, böylece herhangi bir sonuç, onu üreten malzemeye kadar takip edilebilir.
-
Parmak izi karşılaştırması — yeni partiler önceki partilerle ve referans standartlarla, saklama süresine göre karşılaştırılır, yığın, ve kirlilik profili, sadece başarılı/başarısız saflık numarasıyla değil.
-
Belgelenmiş ham veriler — nesnel kanıt (kromatogramlar, kütle spektrumu) özet yüzdesi yerine her partiyle birlikte verilir, böylece tarama laboratuvarları tutarlılığı kendileri değerlendirebilir. Peptit Üretimi
Büyük bir parçalayıcı veya prob kütüphanesi için pratik kural, toplu parmak izi almayı rutin olarak ele alan ve belirli bir partinin önceki isabetlerinizi doğrulayan partiyle nasıl karşılaştırıldığını gösterebilen bir ortaktan kaynak sağlamaktır..
Protein Bozunması Tarama Derecesi: Kaynak Kullandığınızda "Yeterince İyi" Nasıl Görünür?
Bir reaktifi belirlerken veya bir tedarikçiyi değerlendirirken tüm bunları kısa bir beklentiler dizisine dönüştürebilirsiniz.. pratikte, Bozulma iş akışlarını yürüten laboratuvarlar, belirli bir ürünün arkasındaki kalite kontrol konusunu tartışacak ortaklar arar özel peptid sentezi tek bir saflık rakamı vermek yerine sipariş verin.
Esaslar:: sağlam kütleden daha fazlası tarafından doğrulanan kimlik; etiket ve son konjugat üzerinde doğrulanan her değişiklik; Gerektiğinde amino asit veya haritalama düzeyinde analizle belgelenen dizi doğruluğu; Saflık ve karakterizasyon iddialarının ardındaki ortogonal analitik yöntemler; A peptit testi lot başına ham kromatogramları ve kütle spektrumlarını içeren kayıt; ve kitaplık genelinde toplu parmak izi tutarlılığı korunur.
Saygın bir sentez platformu, yakalama dereceli ortogonal ayırma sağlayacaktır, MS/MS düzeyi onayı, Endotoksin ve biyolojik yük limitleri, ve tabloya parti düzeyinde dokümantasyon — çünkü bu, temiz bir ekran üreten bir reaktif ile yüz kuyucukta sessizce yanlış pozitifler üreten bir reaktif arasındaki farktır..
Anahtar Paket Servisi: Protein parçalanması taramasında, reaktif kalitesi test geçerliliğidir. Etiketli türleri ana dizi üzerinden doğrulayın, her değişiklik sitesini onaylayın, ortogonal analitik yöntemleri kullanın, ve gruplar arası parmak izi tutarlılığını zorunlu kılın; çünkü okuma, bunlardan hangisinin atlandığını sessizce yansıtacaktır.
Sonraki Adımlar
Ekranınızın gerçekte bağlı olduğu reaktif sınıflarını yazarak başlayın — muhabir, sonda, veya alt tabaka — ve her birinin ihtiyaç duyduğu analitik belgeler. Kaynak oluştururken bunu temel olarak kullanın, ve tedarikçilerden, çalıştırmak üzere olduğunuz malzemenin ardındaki ortogonal yöntemler ve partiden partiye parmak izi kanıtları konusunda size yol göstermelerini isteyin.. Kalite Kontrol'ü önceden incelemek için harcadığınız birkaç dakika, sizi haftalar süren, tekrarı mümkün olmayan bir tarama sonucundan kurtarabilir.
