Vom Proteom abgeleitete Peptidbibliotheken für die detaillierte Spezifitätsprofilierung von N-terminalen Modifikationsreagenzien

Protein- und Peptid-N-Termini sind wichtige Ziele für die selektive Modifikation mit Chemoproteomik-Reagenzien und Biokonjugationswerkzeugen. Das N-terminale α-Amin kommt in jeder Polypeptidkette nur einmal vor, Dies macht es zu einem attraktiven Ziel für die Proteinbiokonjugation. In Zellen, Neue N-Termini können durch proteolytische Spaltung erzeugt und durch N-terminale Modifikationsreagenzien eingefangen werden, die eine proteomweite Identifizierung von Proteasesubstraten mit Tandem-Massenspektrometrie ermöglichen (LC-MS/MS). Für jede dieser Anwendungen ist ein Verständnis der N-terminalen Sequenzspezifität der Modifikationsreagenzien von entscheidender Bedeutung. Proteom-abgeleitete Peptidbibliotheken in Kombination mit LC-MS/MS sind leistungsstarke Werkzeuge zur Profilierung der Sequenzspezifität von N-terminalen Modifikationsreagenzien. Diese Bibliotheken sind sehr vielfältig, und LC-MS/MS ermöglicht die Analyse der Modifikationseffizienz von Zehntausenden von Sequenzen in einem einzigen Experiment. Von Proteomen abgeleitete Peptidbibliotheken sind ein leistungsstarkes Werkzeug zur Profilierung der Sequenzspezifitäten von enzymatischen und chemischen Peptidmarkierungsreagenzien. Subtiligase und 2-Pyridincarboxaldehyd (2PCA) sind zwei Reagenzien, die für die selektive N-terminale Peptidmodifikation entwickelt wurden und mithilfe von Proteom-abgeleiteten Peptidbibliotheken untersucht werden können. Dieses Protokoll beschreibt die Schritte zur Generierung N-terminal diverser, von Proteomen abgeleiteter Peptidbibliotheken und zur Anwendung dieser Bibliotheken, um die Spezifität von N-terminalen Modifikationsreagenzien zu profilieren. Wir beschreiben detailliert die Schritte zur Profilierung der Spezifität von 2-Pyridincarboxaldehyd, ein chemisches Modifikationsreagenz, und Subtiligase, ein enzymatisches Modifikationsreagens. Diese Protokolle können leicht an alternative Proteomquellen und andere N-terminale Peptidmarkierungsreagenzien angepasst werden.