Um método de dissolução adequado é um fator importante para o sucesso das experiências com péptidos. Uma dissolução incorrecta causará a perda de péptidos e o fracasso da experiência. No entanto, encontrar o método de dissolução ideal é por vezes bastante difícil. Seguem-se os métodos de dissolução propostos pelos dois grupos técnicos da MOL Changes. método
A MOL altera o guia de dissolução do grupo tecnológico
O principal problema na dissolução de péptidos é a formação de estruturas secundárias.
Embora a formação de estruturas secundárias de cadeias peptídicas hidrofóbicas seja mais óbvia, com exceção das cadeias peptídicas mais curtas, este fenómeno ocorre em quase todas as cadeias peptídicas, independentemente da polaridade. Por conseguinte, o primeiro princípio da dissolução de polipéptidos é utilizar água destilada estéril ou água desionizada (ou água sem oxigénio, se as condições o permitirem).
A solução de péptido pode sofrer degradação bacteriana. Para evitar este fenómeno, o péptido deve ser dissolvido em água destilada estéril ou filtrado com uma membrana filtrante com um tamanho de poro de 0,45 ou 0,2 μm para esterilização. Os polipéptidos que contêm Cys, Met e Trp são particularmente susceptíveis à oxidação, pelo que devem ser dissolvidos em água isenta de oxigénio. A água isenta de oxigénio pode ser obtida por desgaseificação sob pressão reduzida através da injeção de gases inertes (azoto, hélio e árgon).
Se o péptido for insolúvel em água pura, o tratamento ultrassónico pode ajudar a quebrar as partículas e aumentar a solubilidade. Nota: O tratamento ultrassónico provoca o aquecimento da solução e a degradação do péptido.
Se o péptido contiver vários aminoácidos básicos, utilizar uma solução aquosa de ácido acético de 1~10%; para péptidos muito hidrofóbicos, utilizar ácido acético de 50%.
Se o polipéptido contiver uma grande quantidade de aminoácidos ácidos, pode ser dissolvido numa solução de amoníaco 1 a 10% ou num tampão alcalino volátil, como o acetato de morfina etílica ou o bicarbonato. O valor do pH deve ser ajustado antes da cromatografia.
Se o péptido for carregado na coluna, a quantidade de solvente orgânico deve ser muito pequena, caso contrário o tempo de retenção será seriamente afetado.
Se o polipéptido for altamente hidrofóbico por conter cadeias laterais de hidrocarbonetos aromáticos, como Val, Leu, Met, Phe, Tyr, Ala, etc., ou se for um péptido neutro, a utilização de desnaturantes de membrana, como DMF ou DMSO, pode ajudar a dissolver o polipéptido:
a. Os desnaturantes de membrana de alta concentração ajudam a dissolver o polipéptido, destruindo a sua estrutura secundária.
b. Os desnaturantes de membrana são adequados para a preparação de soluções de análise de péptidos, mas podem interferir na investigação da sua atividade biológica.
c. O DMF é o melhor desnaturante (a concentração mais elevada pode atingir 30%), e é adicionado gota a gota até o péptido estar dissolvido.
d. Durante a cromatografia de fase reversa, o DMF fluirá juntamente com o pico frontal do eluente. Dependendo do volume de injeção, o valor do pico pode ser muito elevado. A maioria dos péptidos pode ser eluída em poucos minutos após a eluição de uma grande quantidade de DMF. Se a cadeia peptídica for pequena e for eluída demasiado cedo, a quantidade do péptido será reduzida.
A MOL altera o Guia de Dissolução do Grupo Técnico II
Como distinguir se os aminoácidos são neutros, ácidos ou alcalinos e calcular o método de dissolução:
1. Atribuir a cada aminoácido ácido da sequência polipeptídica, incluindo o ácido aspártico Asp (D), o ácido glutâmico Glu (E) e o carboxil-COOH do terminal C, o valor -1; a cada aminoácido básico, incluindo a arginina Arg (R), a lisina Lys (K), a histidina His (H) e o amino-NH2 do terminal N, o valor +1; os aminoácidos neutros o valor 0. Com base nisto, o valor de todo o polipéptido é calculado e a pontuação é positiva Os péptidos com uma pontuação negativa são designados péptidos básicos, os com uma pontuação negativa são designados péptidos ácidos e os com uma pontuação de zero são designados péptidos neutros.
2. Se for um peptídeo alcalino, tente dissolvê-lo primeiro com água; se não puder ser dissolvido, tente usar ácido acético 10% - 30%; se o peptídeo ainda for insolúvel, tente usar ácido acético puro e ácido trifluoroacético TFA (<50 μl) para dissolvê-lo e, em seguida, Dilua a solução de peptídeo até a concentração desejada.
3. Se se tratar de um péptido ácido, tentar dissolvê-lo primeiro com água; se não for possível dissolvê-lo com água, tentar dissolvê-lo com água de amoníaco (v/v) e diluir a solução de péptido até à concentração necessária. Se a sequência peptídica contiver cisteína Cys (C), não pode ser dissolvida numa solução alcalina. Tente os métodos abaixo.
4. Os péptidos neutros são normalmente dissolvidos em solventes orgânicos. Em primeiro lugar, tentar utilizar acetonitrilo (acetonitrilo), metanol (metanol) ou isopropanol (isopropanol) para dissolver; no caso de péptidos muito hidrofóbicos, dissolver primeiro com uma pequena quantidade de dimetilsulfóxido (DMSO) e diluir com água até à concentração requerida; se a sequência peptídica contiver cisteína Cys (C), utilizar dimetilformamida (DMF) ou N-metilpirrolidona (NMP) para dissolução. No caso de péptidos com tendência para se agregarem, adicionar primeiro guanidina-HCl 6M ou ureia 8M (Ureia) para os dissolver e, em seguida, diluir até à concentração necessária.
ilustrar:
1. Para facilitar a armazenagem e a utilização subsequente, recomenda-se que o péptido seja dissolvido numa concentração de cerca de 1-2 mg/ml.
2. O pó liofilizado de péptidos normais pode ser armazenado a -20°C durante mais de um ano. No caso dos péptidos dissolvidos, recomenda-se que sejam aliquotados e armazenados a -20°C; se a sequência peptídica contiver metionina Met (M), cisteína Cys ácida (C) ou tirosina Tyr (Y), recomenda-se que sejam armazenados num ambiente isento de oxigénio para evitar a oxidação.
Lista de aminoácidos em anexo:
1. aminoácidos neutros: glicina, alanina, leucina, isoleucina, valina, cisteína, metionina, treonina, serina, fenilalanina, tirosina, ácido triptofano, prolina, asparagina e glutamina
Fcaracterísticas: Este tipo de molécula de aminoácido contém apenas um grupo amino e um grupo carboxilo
2. aminoácidos ácidos: ácido glutâmico, ácido aspártico
Características: Este tipo de molécula de aminoácido contém um grupo amino e dois grupos carboxilo
3. aminoácidos básicos: lisina, arginina, histidina
Características: Este tipo de aminoácido contém um grupo diaminocarboxilo na sua molécula; a histidina tem um anel de azoto e é fracamente alcalina, sendo também um aminoácido básico.
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