एंजाइम समस्या पेप्टाइड को बायपास करने के लिए डिज़ाइन किया गया है
एसिटाइल हेक्सापेप्टाइड 1 थोक पेप्टाइड स्रोत सह-प्रकार नाइट्राइल हाइड्रैटेज़ सक्रिय साइट एक कम-स्पिन कंपनी रखती है(तृतीय) N2S3 प्रथम समन्वय क्षेत्र में: रीढ़ की हड्डी से दो एमिडेट नाइट्रोजन और तीन अलग-अलग ऑक्सीकरण अवस्थाओं में तीन सिस्टीन-व्युत्पन्न सल्फर - एक थायोलेट, एक सल्फ़नेट और एक सल्फ़नेट. The 1.8 Å की क्रिस्टल संरचना स्यूडोनोकार्डिया थर्मोफिला एंजाइम (पीडीबी 1आईआरई) αCys111 को सिस्टीन-सल्फिनिक एसिड के रूप में और αCys113 को सिस्टीन-सल्फेनिक एसिड के रूप में विघटित करता है, लौह एंजाइम में भी यही पैटर्न देखा जाता है.
वहां पहुंचना कोई सहज कदम नहीं है. परिपक्वता के लिए एक उत्प्रेरक प्रोटीन की आवश्यकता होती है, और के लिए पंNHase झोउ और सहकर्मियों ने एक α-सबयूनिट स्वैपिंग तंत्र का प्रस्ताव रखा: एक apo-α2β2 टेट्रामर पहले बनता है, एक एकल α-सबयूनिट दो Co को बांधता है(द्वितीय)-ε प्रोटीन युक्त, कोबाल्ट डाला जाता है और धातु प्लस इक्वेटोरियल सिस्टीन ऑक्सीकृत हो जाते हैं, और अब-कार्यात्मक α-सबयूनिट्स को एपो-टेट्रामर में बदल दिया जाता है. फ्रंटियर्स अध्ययन में स्पष्ट रूप से कहा गया है कि परमाणु स्तर पर यह कैसे होता है, इसके बारे में बहुत कम जानकारी है.
यही व्याख्यात्मक समस्या है. होलोएंजाइम में, धातु प्रविष्टि, सिस्टीन ऑक्सीकरण, सबयूनिट असेंबली और एक्टिवेटर की भागीदारी ओवरलैपिंग समय पर एक ही स्थान पर होती है. परिपक्व होने वाले एंजाइम नमूने में स्पेक्ट्रोस्कोपिक परिवर्तन उन कारणों में से किसी एक को नहीं सौंपा जा सकता है, क्योंकि बाकी लोग अभी भी दौड़ रहे हैं. मचान को हटा देने से प्रासंगिकता ख़त्म नहीं हो जाती; यह उन उलझनों को दूर करता है जो मूल सिस्टम को एक समय में एक चर को अपठनीय बनाते हैं.
वास्तव में "मोटिफ़ पर मॉडलिंग" क्या निर्दिष्ट करती है
संरक्षित रूपांकन CXXCSCX है, और अध्ययन इसे NHases के बीच सर्वव्यापी बताता है. से प्राप्त निर्माण पंNHase मूल भाव Ac-VCTLCSCY है: आठ अवशेष, आणविक द्रव्यमान 933.13 और, घुलनशीलता बढ़ाने के लिए एन-टर्मिनस पर एक एसिटाइल समूह जोड़ा गया. पेप्टाइड की आपूर्ति लियोफिलाइज्ड पाउडर के रूप में की गई थी >98.5% शुद्धता और प्रदान के अनुसार उपयोग किया जाता है.
प्रत्येक स्थितीय तत्व कार्य करता है. सिस्टीन रिक्ति सेट होती है जहां थियोलेट्स एक दूसरे और धातु के सापेक्ष बैठते हैं. Ser6 समन्वयित सिस्टीन के बीच बैठता है, और कम्प्यूटेशनल मॉडल में इसकी साइड चेन हाइड्रोजन-बॉन्ड दो स्पष्ट बाहरी क्षेत्र के पानी के माध्यम से बाध्य सिस्टीन सल्फर से जुड़ती है. सी-टर्मिनल टायरोसिन प्रायोगिक पेप्टाइड में मौजूद है लेकिन डीएफटी मॉडल में इसे मिथाइल समूह में छोटा कर दिया गया है।, जैसा कि वैल की गैर-समन्वयकारी पार्श्व श्रृंखलाएं थीं, थ्र और लेउ; एन-टर्मिनल एसिटाइल को फॉर्माइल के रूप में तैयार किया गया था. लगभग सभी रीढ़ की हड्डी के परमाणु और Cys2 की पार्श्व श्रृंखलाएँ, Cys5, Ser6 और Cys7 को बरकरार रखा गया.
निर्माण की ईमानदार सीमा लचीलापन है. बफर में आठ-अवशेष पेप्टाइड एक समन्वय ज्यामिति नहीं रखता है; यह कई नमूने लेता है, यही कारण है कि ईपीआर स्पेक्ट्रम एक के बजाय दो स्पिन अवस्थाएँ दिखाता है. मॉडलों को भी ध्रुवीकरणीय सातत्य के साथ छोटा और हल किया गया है (ई = 80.4) प्लस दो स्पष्ट जल - एक उचित उपचार, लेकिन पूर्ण पेप्टाइड नहीं.
विशिष्टता परिणाम प्रत्यक्ष है. एक एसिटाइल कैप छोड़ा गया, एक अवशेष प्रतिस्थापित, या एक सिस्टीन पैटर्न तले हुए लिगैंड सेट को बदल देता है. कोई भी डाउनस्ट्रीम स्पेक्ट्रोस्कोपी गलत लिगैंड सेट वाले पेप्टाइड से इच्छित प्रयोग को पुनर्प्राप्त नहीं करता है; यह बस समान अनुमानित द्रव्यमान वाले एक अलग अणु पर रिपोर्ट करेगा.
लघु पेप्टाइड एक नियंत्रणीय मॉडल क्यों है?, सरलीकृत एंजाइम नहीं
लेखकों ने जो प्रश्न उठाया वह संकीर्ण था: क्या संरक्षित NHase धातु-बाइंडिंग अनुक्रम में Co को बांधने के लिए पर्याप्त रासायनिक जानकारी होती है?(द्वितीय) और डाइअॉॉक्सिन के संपर्क के बाद धातु केंद्र और पेप्टाइड में परिवर्तन से गुजरना? यह एक अनुक्रम के बारे में प्रश्न है, और एक अनुक्रम वह है जो एक सिंथेटिक पेप्टाइड बाकी प्रोटीन के बिना प्रदान करता है.
इसी प्लेटफ़ॉर्म का उपयोग पहले से ही धातुओं में किया जा चुका है. समान पेप्टाइड एक उच्च-स्पिन Fe को बांधता है(द्वितीय) अवायवीय रूप से केन्द्रित करें, और O₂ एक्सपोज़र पहले एक इंटरमीडिएट-स्पिन उत्पन्न करता है (एस = 3/2) फ़े(तृतीय) केंद्र जो लो-स्पिन Fe में परिवर्तित होता है(तृतीय) जैसे ही भूमध्यरेखीय सिस्टीन ऑक्सीकरण होता है. एक ऐसा निर्माण जिसे पहले लोहे और फिर कोबाल्ट से लोड किया जा सकता है, और उसी स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा पढ़ा जाता है, एकबारगी अणु के बजाय पुन: प्रयोज्य परीक्षण बिस्तर है.
निकटतम बाहरी तुलना सोडा पेप्टाइड है (एसीडीएलपीजी), निकल सुपरऑक्साइड डिसम्यूटेज़ से सात-अवशेष अनुक्रम. में ब्रोयरिंग और सहकर्मियों का अध्ययन, सह-सोडा दो समाधान योग्य चरणों में ऑक्सीकृत हुआ: कुछ ही सेकंड में धातु अनुचुंबकीय बनी रही (सह²⁺) जबकि सल्फर के-एज एक्सएएस ने एक थायोलेट को सल्फिनेट में परिवर्तित होते दिखाया; घंटों से अधिक, चुंबकीय संवेदनशीलता और Co K-एज XAS ने धातु को Co³⁺ में जाते हुए दिखाया. दूसरा थियोलेट आगे ऑक्सीकरण नहीं हुआ और कोई उत्प्रेरक रूप से सक्रिय कॉम्प्लेक्स नहीं बना - अक्षीय थियोलेट की अनुपस्थिति के कारण. यह एक अलग ऑक्सीकरण अनुक्रम के साथ एक अलग पेप्टाइड है, और इसे Ac-VCTLCSCY परिणामों के साथ विलय नहीं किया जाना चाहिए; यहां इसका मूल्य एक मिसाल के रूप में है कि मेटालोपेप्टाइड क्या हल कर सकता है और क्या नहीं.
समीक्षा साहित्य इसका प्रतिकार प्रदान करता है. शेलेव की धातु-पेप्टाइड एनएमआर की समीक्षा ध्यान दें कि संरचना गणना के दौरान गलत ज्यामिति के अनुरूप होने के लिए पेप्टाइड्स पर्याप्त लचीले होते हैं, ग़लत संरचनात्मक परिणाम उत्पन्न करना, और पेप्टाइड-व्युत्पन्न मॉडल कम आत्मीयता के साथ बंध सकते हैं क्योंकि सभी बाध्यकारी भाग संरक्षित नहीं हैं. यह दृष्टिकोण के विरुद्ध कोई तर्क नहीं है; यही कारण है कि कम्प्यूटेशनल मॉडल और एकाधिक स्पेक्ट्रोस्कोपी को एक साथ पढ़ना पड़ता है. एक मॉडल जो परिभाषित में गलत है, निरीक्षण योग्य तरीका आपको एक होलोनीजाइम से अधिक बताता है जो उन कारणों के लिए सही है जिन्हें कोई भी अलग नहीं कर सकता है.
कोबाल्ट ने वास्तव में क्या किया: समन्वय और स्पिन राज्य
अवायवीय परिस्थितियों में, कंपनी का यूवी-दृश्यमान स्पेक्ट्रम(द्वितीय)-पेप्टाइड कॉम्प्लेक्स ने तीव्र लिगैंड-टू-मेटल चार्ज ट्रांसफर बैंड दिखाए 305 एनएम (ई = 2800 एम⁻¹सीएम⁻¹) और 355 एनएम (ई = 2180 एम⁻¹सीएम⁻¹), सिस्टीन थियोलेट-टू-को को सौंपा गया(द्वितीय) चार्ज स्थानांतरण. क्योंकि तुलनीय मेटालोपेप्टाइड अध्ययन प्रत्येक थियोलेट-सीओ डालते हैं(द्वितीय) लगभग 900-1200 M⁻¹cm⁻¹ पर अंतःक्रिया, देखी गई तीव्रताएं दो बाध्य थिओलेट्स के अनुरूप हैं, तीसरे सिस्टीन को कमजोर या गैर-समन्वयित छोड़ना. लगभग कमजोर लिगैंड-फील्ड बैंड 615, 685 और 735 एनएम (ε ≈ 300-400 M⁻¹cm⁻¹) ऑक्टाहेड्रल कंपनी की तुलना में तीव्रता अधिक होती है(द्वितीय) आम तौर पर देता है, चार या पाँच की समन्वय संख्या की ओर इशारा करते हुए.
कंपनी के साथ एपो-पेप्टाइड का अनुमापन(द्वितीय) ~685 एनएम पर अवशोषण की निगरानी करते समय प्रति पेप्टाइड लगभग एक बाइंडिंग साइट फिट होती है, एक स्पष्ट के साथ केडी,का ऐप 0.45 माइक्रोन. लेखक इस बारे में स्पष्ट हैं कि वह संख्या क्या सहन कर सकती है: क्योंकि पेप्टाइड सांद्रता फिट किए गए मूल्य से काफी अधिक थी, अनुमापन कसकर स्थापित होता है, लगभग स्टोइकोमेट्रिक बाइंडिंग लेकिन उप-माइक्रोमोलर पृथक्करण स्थिरांक को कठोरता से निर्धारित नहीं करता है. यह मान सह-नीएसओडी और सह-सोडा पेप्टाइड कॉम्प्लेक्स के लिए रिपोर्ट किए गए मूल्य के बराबर है.
एक्स-बैंड ईपीआर पर 12 K ने दो संकेतों का समाधान किया. पहली थोड़ी रंबिक लो-स्पिन कंपनी है(द्वितीय) के साथ सुविधा जी-के मान 2.30, 2.25 और 2.03; एल-बैंड ईपीआर पर 1.3 GHz ध्वस्त हो गया जी-हल करने के लिए पर्याप्त तनाव डालें मैं = 7/2 अति सूक्ष्म संरचना अधिक स्पष्ट रूप से. दूसरा बीच में एक कम आयाम वाला उच्च-स्पिन सिग्नल है 1,000 और 2,000 जी पर सुलझे हुए मोड़ के साथ जी' = 5.7 और 4.8, एक के अनुरूप एस = 3/2 प्रणाली. एकीकरण ने अवायवीय परिस्थितियों में दोनों के लिए लगभग समान सापेक्ष तीव्रताएँ दीं.
डीएफटी ने उच्च-स्पिन प्रजातियों के लिए एक विकृत टेट्राहेड्रल N2S2 ज्यामिति और पांच-समन्वय का समर्थन किया, निम्न-स्पिन प्रजातियों के लिए विकृत वर्ग-पिरामिड ज्यामिति, तटस्थ CysSH की तीन संभावित स्थितियों में छह मॉडल तैयार किए गए (Cys2, Cys5 या Cys7). गणना जी-पाँच-समन्वय मॉडल के लिए मान (1.98-2.57) प्रायोगिक 2.03-2.40 रेंज के साथ उचित समझौते में गिरावट, और Cys7 पर तटस्थ थियोल वाले मॉडल ने प्रयोगात्मक के अक्षीय चरित्र को पुन: उत्पन्न किया जी-टेंसर विशेष रूप से अच्छी तरह से. लेखकों की व्याख्या - एक लचीली मचान के भीतर उपलब्ध कई समन्वय ज्यामिति - गणना और स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा एक साथ समर्थित एक व्याख्या है, मापी गई संरचना नहीं.
ऑक्सीकरण: क्या बदल गया, क्या अनुमान लगाया गया, और क्या हल नहीं हुआ
डाइऑक्सीजन के संपर्क में आने से कंपनी ख़त्म हो गई(द्वितीय) ईपीआर तेजी से संकेत देता है, उच्च के अनुपात में कोई ऑक्सीजन-निर्भर परिवर्तन नहीं- और सिग्नल ख़त्म होने से पहले कम स्पिन वाली प्रजातियों का आकलन किया जा सकता था. कंपनी के साथ तुलना(द्वितीय) बफर में दो चीजें स्थापित हुईं: जलीय कोबाल्ट से हाई-स्पिन सिग्नल कॉम्प्लेक्स में सिग्नल से अलग था, और वायु संपर्क ने केवल कोबाल्ट को पेप्टाइड से मुक्त नहीं किया. सिग्नल का नुकसान ईपीआर-साइलेंट लो-स्पिन कंपनी के ऑक्सीकरण के अनुरूप है(तृतीय), और यूवी-दृश्यमान स्पेक्ट्रम तदनुसार बदल गया - बीच में डी-डी संक्रमण 600 और 750 एनएम कम हो गया और गायब हो गया जबकि नए बैंड लगभग दिखाई दिए 350, 465 और 620 एनएम, थियोलेट-टू-को की विशेषता(तृतीय) चार्ज स्थानांतरण.
पेप्टाइड पक्ष पर, क्यू-टीओएफ एलसी-एमएस ने हवा के संपर्क के बाद तीन ऑक्सीजन परमाणुओं के समावेश के अनुरूप संकेत दिखाए. ऑक्सीजन युक्त प्रजातियों की सापेक्ष तीव्रता में वृद्धि हुई 10 और 15 एच, और उच्चा-एम/जेड चोटियाँ संभवतः पानी के स्रोतों से मेल खाती हैं. बदलाव सिस्टीन ऑक्सीकरण से सल्फेनिक और सल्फिनिक एसिड डेरिवेटिव के अनुरूप हैं, मूल सक्रिय साइट में वही संशोधन पाए गए.
डेटा दो चीजें स्थापित नहीं करता है, और अखबार ऐसा कहता है. मास स्पेक्ट्रोमेट्री सीधे धातु केंद्र की ऑक्सीकरण अवस्था स्थापित नहीं करती है. और धातु और लिगैंड ऑक्सीकरण का क्रम वर्तमान डेटा से स्थापित नहीं किया जा सकता है - परिणाम दर्शाते हैं कि दोनों प्रक्रियाएं डाइऑक्सीजन के साथ प्रतिक्रिया के दौरान होती हैं, वह नहीं जो पहले जाता है.
परिणाम जितना ही नियंत्रण मायने रखता है. पेप्टाइड-केवल समाधान हवा के संपर्क में आने पर रंगहीन रहा लेकिन अंततः अवक्षेपित हो गया, संभवतः डाइसल्फ़ाइड निर्माण के माध्यम से. कोबाल्ट के बिना भी छोटी ऑक्सीजन युक्त प्रजातियाँ दिखाई दीं, नमूना संभालने के दौरान निम्न-स्तरीय सिस्टीन ऑक्सीकरण के अनुरूप. यह अध्ययन का अपना प्रमाण है कि काल्पनिक के बजाय आधारभूत ऑक्सीकरण पृष्ठभूमि अपेक्षित है.
लेखक भविष्योन्मुखी सावधानी भी बरतते हैं: लंबे समय तक ऑक्सीजन के संपर्क में रहने से अधिक व्यापक रूप से ऑक्सीकृत प्रजातियाँ उत्पन्न हो सकती हैं, संभावित रूप से ओवरऑक्सीडाइज्ड के अनुरूप बीआईएस-सल्फिनिक-एसिड वातावरण शामिल है, निष्क्रिय NHase. ऊष्मायन समय बढ़ाने वाले किसी भी व्यक्ति के लिए, यह परीक्षण के लिए एक भविष्यवाणी है, कोई निश्चित परिणाम नहीं.
विश्लेषणात्मक पुष्टि: कौन सी तकनीक किस प्रश्न का उत्तर देती है
इस अध्ययन की प्रत्येक तकनीक एक प्रश्न का उत्तर देती है और उससे अनभिज्ञ है लेबल पेप्टाइड्स अन्य. मेटालोपेप्टाइड पेपर को पढ़ने का अर्थ है यह जानना कि कौन सा क्या है.
यूवी-दृश्य अवशोषण उत्तर देता है कि क्या थायोलेट धातु से बंधा है और मोटे तौर पर कितना, ~900-1200 M⁻¹cm⁻¹ प्रति-थिओलेट बेंचमार्क के विरुद्ध LMCT बैंड की तीव्रता के माध्यम से. यह स्पिन स्थिति या ज्यामिति का समाधान नहीं कर सकता, और यह आपको नहीं बता सकता कि कौन सा सिस्टीन बंधा हुआ है.
एमसीडी और ईपीआर जवाब देते हैं कि कौन सी स्पिन अवस्थाएं मौजूद हैं और किस अनुपात में हैं; एकीकृत ईपीआर तीव्रता ने लगभग समान उच्च/निम्न-स्पिन अनुपात दिया, और एल-बैंड रिज़ॉल्यूशन ने हाइपरफाइन संरचना के माध्यम से कम-स्पिन असाइनमेंट की पुष्टि की. लेकिन ईपीआर ईपीआर-साइलेंट कंपनी के प्रति अंधा है(तृतीय), इसलिए सिग्नल का गायब होना सीधे माप के बिना ऑक्सीकरण के अनुरूप है.
एलसी-एमएस उत्तर देता है कि पेप्टाइड पर कितने ऑक्सीजन हैं और यह समय के साथ कैसे बढ़ता है. यह इस बारे में कुछ नहीं कहता कि कौन सा सल्फर उन्हें ले जाता है, और धातु की ऑक्सीकरण अवस्था के बारे में कुछ भी नहीं. ऑक्सीडेटिव-संशोधन द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री की सामान्य सीमाएँ अच्छी तरह से प्रलेखित हैं - संशोधन-विशिष्ट कार्यप्रवाह ध्यान दें कि किसी विशिष्ट अवशेष में संशोधन निर्दिष्ट करने के लिए आमतौर पर एमएस/एमएस व्याख्या की आवश्यकता होती है, और निकाले गए आयन क्रोमैटोग्राम से ऑक्सीकृत बनाम गैर-ऑक्सीकृत प्रजातियों की मात्रा निर्धारित करना तुलनीय आयनीकरण और संचरण दक्षता मानता है.
डीएफटी उत्तर देता है कि कौन से समन्वय मॉडल ज्यामितीय और ऊर्जावान रूप से प्रशंसनीय हैं, लेकिन केवल वास्तव में गणना किए गए काटे गए मॉडल के लिए - समाधान में पूर्ण पेप्टाइड के लिए नहीं.
संश्लेषण पक्ष पर, अध्ययन के स्वयं के रिलीज़ चेक शिक्षाप्रद हैं: में मुफ्त थिओल्स 0.76 एल्मैन के परीक्षण से एमएम एपो-पेप्टाइड स्टॉक की पुष्टि हुई, और दाढ़ अवशोषकता पर 280 एनएम (1,096 एम⁻¹सीएम⁻¹) एक मानक वक्र से स्थापित किया गया था ताकि अनुमान लगाने के बजाय एकाग्रता को जाना जा सके. न ही मेटालोप्रोटीन लक्षण वर्णन तकनीक है, और दोनों एक के लिए आवश्यक शर्तें हैं.
व्यावहारिक नियम: इस सूची में कोई भी एक तकनीक पर्याप्त नहीं है. एक लक्षण वर्णन रिपोर्ट जो केवल एक की पेशकश करती है, उसमें मेटालोपेप्टाइड की विशेषता नहीं है.
पवित्रता, पहचान, सामग्री और ऑक्सीकरण अवस्था चार अलग-अलग प्रश्न हैं
एक नमूना हो सकता है 98% एचपीएलसी द्वारा शुद्ध और कंपनी के लिए अभी भी अनुपयोगी है(द्वितीय) प्रयोग. पामिटॉयल पेंटापेप्टाइड-4 एक बार जब चार प्रश्नों को अलग रख दिया जाए तो स्पष्ट विरोधाभास समाप्त हो जाता है.
एचपीएलसी द्वारा शुद्धता सापेक्ष क्षेत्र प्रतिशत है. यह बताता है कि यूवी-अवशोषित सामग्री का कितना भाग मुख्य शिखर के रूप में उत्सर्जित होता है. यह नहीं बताता कि वह शिखर क्या है, और यह उस सिस्टीन को अलग नहीं करता है जो पहले से ही ऑक्सीकृत सिस्टीन से कम हो जाता है यदि दोनों एक साथ घुल जाते हैं.
पहचान ऑर्थोगोनल संरचनात्मक पुष्टि है. यहां इसका मतलब मास स्पेक्ट्रोमेट्री है, और अध्ययन का अपना एलसी-एमएस दिखाता है कि एकल द्रव्यमान माप की सीमाएं क्यों हैं: एक बार ऑक्सीजन की आपूर्ति द्रव्यमान को स्थानांतरित कर देती है 16 दा प्रति ऑक्सीजन, एक ऑक्सीकृत पेप्टाइड और एक अलग पेप्टाइड को तब तक भ्रमित किया जा सकता है जब तक कि द्रव्यमान रिज़ॉल्यूशन और क्रोमैटोग्राफ़िक संदर्भ पर्याप्त न हो.
सामग्री, या नेट पेप्टाइड, द्रव्यमान संतुलन है - पेप्टाइड प्लस काउंटरियन, पानी और नमक. यह सीधे यहां मायने रखता है क्योंकि बाइंडिंग अनुमापन की स्टोइकोमेट्री यह जानने पर निर्भर करती है कि क्युवेट में वास्तव में कितना पेप्टाइड है. सामग्री निर्धारण के बिना तौले गए पाउडर से गणना की गई नाममात्र सांद्रता एक फिट बाइंडिंग वक्र को स्थानांतरित करने के लिए पर्याप्त हो सकती है.
ऑक्सीकरण अवस्था सिस्टीन और धातु का एक गुण है जो न तो एचपीएलसी और न ही अक्षुण्ण द्रव्यमान स्पष्ट रूप से रिपोर्ट करता है. एक लियोफिलिज्ड पाउडर जो है 98% एचपीएलसी द्वारा शुद्ध में सिस्टीन का एक सार्थक अंश पहले से ही हैंडलिंग और लियोफिलाइजेशन से सल्फेनिक या डाइसल्फ़ाइड रूपों में ऑक्सीकृत हो सकता है।. वह थोड़े अधिक द्रव्यमान के रूप में प्रस्तुत होगा, एक स्थानांतरित अवधारण समय, या एल्मैन द्वारा बस एक छोटा फ्री-थिओल टिटर. अध्ययन में कोबाल्ट की अनुपस्थिति में छोटी ऑक्सीजन युक्त प्रजातियों का अवलोकन किया गया, नमूना प्रबंधन को जिम्मेदार ठहराया गया, यह इस बात का प्रमाण है कि यह पृष्ठभूमि वास्तविक है.
निर्णय नियम का पालन होता है: ऑक्सीकरण-संवेदनशील मेटलोपेप्टाइड कार्य के लिए, रिलीज़ मानदंड के रूप में फ्री-थियोल सामग्री और ऑक्सीकरण प्रोफ़ाइल निर्दिष्ट करें, सिर्फ एचपीएलसी शुद्धता और सामूहिक जांच ही नहीं. ऐसी विशिष्टताओं के पीछे विश्लेषणात्मक सिद्धांत वही हैं जो इसमें दिए गए हैं मैं Q2(आर2), जो पहचान का इलाज करता है, शुद्धता और परख को विनिमेय विशेषताओं के बजाय विशिष्ट प्रदर्शन विशेषताओं के रूप में देखा जाता है.
मेटल हैंडलिंग और ऑक्सीजन-संवेदनशील वर्कफ़्लो
अध्ययन रिपोर्ट क्या विशिष्ट है और बिल्कुल नकल करने लायक है. सभी पेप्टाइड नमूने एक कॉय सॉफ्ट-साइडेड ग्लव बॉक्स में अवायवीय परिस्थितियों में तैयार किए गए थे. पेप्टाइड को डीगैस्ड में घोल दिया गया 10 एमएम एन-एथिल मॉर्फोलिन (नहीं) पीएच पर बफर 8.0, बेरंग दे रहा है 0.76 एमएम एपो-पेप्टाइड स्टॉक जो घुलनशील था और एल्मैन के परीक्षण द्वारा मुक्त थिओल्स के लिए पुष्टि की गई थी. CoCl₂·6H₂O का एक समकक्ष, एक ही pH पर एक ही बफर में घुल जाता है, बफ़र्ड पेप्टाइड में जोड़ा गया था.
कागज़ के बजाय समन्वय रसायन शास्त्र से जो निष्कर्ष निकलता है वह डिज़ाइन तर्क के रूप में बताने लायक है. जोड़ने का क्रम और धातु-से-पेप्टाइड अनुपात यह निर्धारित करता है कि क्या इरादा है 1:1 जटिल रूप या मिश्रण होता है; इसीलिए अनुमापन को कल्पित करने के बजाय चलाया गया. बफ़र का चयन मायने रखता है क्योंकि समन्वयित बफ़र्स धातु के लिए प्रतिस्पर्धा करते हैं, और एनईएम को गैर-समन्वय मॉर्फोलिन बफर के रूप में चुना गया था. और हवा के संपर्क में पेप्टाइड-केवल अवक्षेपण का मतलब है कि डाइसल्फ़ाइड गठन एक प्रतिस्पर्धी मार्ग है जो कोबाल्ट को बांधने से पहले समाधान से पेप्टाइड को हटा देता है - एक हानि चैनल जो हैंडलिंग समय के साथ बढ़ता है. अग्नाशयी पॉलीपेप्टाइड
ईमानदार अंतर: पेपर धातु अनुपात के व्यवस्थित अनुकूलन की रिपोर्ट नहीं करता है, जोड़ने या बफर पहचान का क्रम. एक पाठक इसे बढ़ाते हुए इस पद्धति का विस्तार कर रहा है, इसकी नकल नहीं कर रहा हूँ, और उनमें से प्रत्येक चर को सार्वभौमिक आवश्यकता के बजाय अपने स्वयं के सिस्टम में पुष्टि करने के लिए कुछ के रूप में व्यवहार करना चाहिए.
क्या आर&डी लीड को ऑक्सीकरण-संवेदनशील मेटालोपेप्टाइड चालू करने से पहले पूछना चाहिए
नीचे दिए गए प्रश्न वे हैं जो यह तय करते हैं कि खरीदा गया मेटालोपेप्टाइड प्रयोग का समर्थन करता है या नहीं. विशिष्ट बातचीत में प्रत्येक जवाबदेह है.
अनुक्रम और संस्करण. क्या सटीक अनुक्रम - एन-टर्मिनल एसिटाइल और किसी भी गैर-मानक अवशेष सहित - एक संस्करण-नियंत्रित रिकॉर्ड के रूप में दर्ज किया गया है, और क्या प्रमाणपत्र यह बताता है? अपरिवर्तनीय संस्करण ट्रेल के बिना अनुक्रम संपादन गैर-पुनरुत्पादित मेटालोपेप्टाइड प्रयोग का सबसे आम कारण है.
सिस्टीन स्थिति. रिलीज़ के समय फ्री-थिओल सामग्री क्या है?, किस विधि से, और कौन सी ऑक्सीकरण प्रजातियां सीमा के रूप में निर्दिष्ट हैं? यह वह प्रश्न है जिसे अध्ययन के स्वयं के हैंडलिंग-ऑक्सीकरण अवलोकन ने गैर-परक्राम्य बना दिया है. एसिटाइल हेक्सापेप्टाइड-1 निर्माता
पहचान. क्या एकल द्रव्यमान माप से परे ऑर्थोगोनल पुष्टि है, और क्या मास स्पेक्ट्रोमेट्री ऑक्सीजन योजकों का समाधान करती है? एक ऐसी विधि जो अलग नहीं हो सकती +16 माता-पिता से दा ऑक्सीकरण प्रोफ़ाइल की रिपोर्ट नहीं कर सकता.
सामग्री. क्या शुद्ध पेप्टाइड सामग्री एचपीएलसी शुद्धता से अलग बताई गई है, और प्रतिवाद रूप बताया गया है? बाइंडिंग अनुमापन में स्टोइकोमेट्री पहले पर निर्भर करती है; बफर व्यवहार और धातु प्रतिस्पर्धा दूसरे पर निर्भर हो सकती है.
हैंडलिंग. क्या सामग्री ऐसे रूप और पैकेजिंग में आपूर्ति की जाती है जो अवायवीय पुनर्गठन का समर्थन करती है, और क्या दस्तावेज़ ऐसा कहता है?? एक लियोफिलाइज्ड पाउडर सुविधाजनक है, लेकिन पुनर्गठन चरण वह है जहां ऑक्सीजन प्रवेश करती है.
विश्लेषणात्मक पैकेज. क्या कच्चे क्रोमैटोग्राम और स्पेक्ट्रा विधि पहचानकर्ताओं - कॉलम के साथ प्रदान किए जाते हैं, ग्रेडियेंट, तरंग दैर्ध्य, द्रव्यमान सीमा - सारांश तालिका के बजाय? जब कोई परिणाम गलत दिखता है तो सारांश तालिका की दोबारा जांच नहीं की जा सकती.
पैमाना. यदि मॉडल मिलीग्राम से बड़े बैचों में परिवर्तित होता है, क्या ऑक्सीकरण प्रोफ़ाइल के बने रहने की उम्मीद करने का कोई घोषित आधार है?? ऑक्सीकरण-संवेदनशील अनुक्रम बिल्कुल वही हैं जहां प्रक्रिया परिवर्तन सबसे पहले दिखाई देते हैं.
सिस्टीन-स्थिति प्रश्न का उत्तर देने में असमर्थ एक आपूर्तिकर्ता आपको प्रमाणपत्र के पीछे परख क्षमता के बारे में कुछ बता रहा है. यह सूची में सबसे अधिक जानकारीपूर्ण उत्तर है.
जहां मॉडल रुकता है
पेप्टाइड एंजाइम नहीं है. इसमें β-सबयूनिट का अभाव है, उत्प्रेरक प्रोटीन, दूसरा समन्वय क्षेत्र और सबयूनिट-स्वैपिंग परिपक्वता मार्ग. अध्ययन की तुलना मूल प्रणाली से स्पिन अवस्था और लिगैंड संशोधन के सादृश्य से की गई है, उत्प्रेरक गतिविधि द्वारा नहीं - यहां कोई नाइट्राइल हाइड्रेशन नहीं मापा गया था.
इस प्रणाली में धातु बनाम लिगैंड ऑक्सीकरण का क्रम अनसुलझा रहता है, जैसा कि लेखक बताते हैं. बाइंडिंग स्थिरांक एक स्पष्ट मूल्य है जिसे उन स्थितियों के तहत मापा जाता है जो कठोर उप-माइक्रोमोलर निर्धारण की अनुमति नहीं देते हैं. डीएफटी मॉडल को छोटा कर दिया गया है और सातत्य-समाधान किया गया है. और देखा गया ऑक्सीकरण रसायन बफर में एक पृथक रूपांकन के साथ होता है - रूपांकन की आंतरिक प्रतिक्रियाशीलता के बारे में एक बयान, अंतःकोशिकीय परिपक्वता क्रम के बारे में कोई दावा नहीं.
इनमें से कोई भी परिणाम को कमजोर नहीं करता है. यह परिभाषित करता है कि परिणाम क्या समर्थन करता है: कि संरक्षित अनुक्रम अकेले ही कंपनी को बांधने के लिए पर्याप्त रासायनिक जानकारी रखता है(द्वितीय) और डाइऑक्सीजन के संपर्क में आने पर युग्मित धातु और सिस्टीन ऑक्सीकरण से गुजरना पड़ता है.
निष्कर्ष
आठ-अवशेष पेप्टाइड मायने रखता है क्योंकि यह एक कठिन परिपक्वता प्रश्न को मापने योग्य चर के एक सेट में परिवर्तित करता है - समन्वय संख्या, स्पिन अवस्था, ऑक्सीजन गिनती, फ्री-थिओल स्थिति - प्रत्येक एक तकनीक के साथ जो इस पर रिपोर्ट करती है और एक दस्तावेजी ब्लाइंड स्पॉट है. यह निष्कर्ष कि केवल संरक्षित रूपांकन ही कंपनी को बांधता है(द्वितीय) और हवा के संपर्क में आने पर युग्मित धातु और सिस्टीन ऑक्सीकरण से गुजरता है जो अनुक्रम की आंतरिक रासायनिक जानकारी के बारे में एक बयान है।.
यह केवल नमूने की अनुक्रम निष्ठा जितनी ही भरोसेमंद है, ऑक्सीकरण अवस्था और विश्लेषणात्मक दस्तावेज़ीकरण. इस प्रकार के मॉडल पर टीमों के निर्माण के लिए, अगला चरण क्रय आदेश के बजाय विनिर्देश वार्तालाप है: फ्री-थियोल सामग्री को परिभाषित करें, ऑक्सीकरण सीमा, पहला मिलीग्राम बनने से पहले शुद्ध पेप्टाइड सामग्री और कच्चा डेटा पैकेज. एमओएल परिवर्तन एचपीएलसी और एमएस दस्तावेज़ीकरण के साथ कस्टम पेप्टाइड्स की आपूर्ति करता है, वैकल्पिक पेप्टाइड सामग्री निर्धारण और काउंटरियन विश्लेषण, और अनुरोध पर अवायवीय-संगत हैंडलिंग; वे क्षमताएं उपरोक्त विनिर्देश प्रश्नों के लिए प्रासंगिक हैं, और पाठकों को आपूर्तिकर्ता-चयन मार्गदर्शन का मूल्यांकन करते समय उस व्यावसायिक हित को ध्यान में रखना चाहिए.
एमओएल चेंजेस एक पेप्टाइड विज्ञान आर है&डी संगठन और कस्टम पेप्टाइड्स और विश्लेषणात्मक परीक्षण सेवाओं की आपूर्ति करता है. इस लेख में आपूर्तिकर्ता-चयन मार्गदर्शन का मूल्यांकन करते समय पाठकों को इस व्यावसायिक हित को ध्यान में रखना चाहिए.
मुख्य स्रोत: मूल कोबाल्ट मेटालोपेप्टाइड अध्ययन.
