Mgbanwe Ngbanwe Peptide na-abanye cell: 5-Usoro Usoro

Otu esi eji Nhazi Mgbanwe Peptide na-abanye n'ime cell a

Usoro nhazi peptide nke na-abanye n'ime cell a na-aga n'usoro ise: kọwaa profaịlụ ngwaahịa ebumnuche, họrọ klas mgbanwe megide profaịlụ ahụ, enyo enyo, nkwụsi ike, nsi, solubility na ọrụ n'otu aka ahụ, kwado ụdị ọ bụla gbanwetụrụ na nyocha, wee kọwapụta ihe ndị dị ndụ. Usoro ahụ bụ ụma, na ọ na-amalite na nha karịa kemistri n'ihi na otu ịgụ akwụkwọ agụghị akwụkwọ enweghị ike ịme mkpebi ahụ.

Ọnụọgụ ahụ gosiri ihe kpatara ya. N'ime ihe ọmụmụ endosomal-escape quantitative, peptides na-abanye n'ime cell nke ọma (R9, TAT, ZF5.3, E5TAT) welitere mkpokọta cellular mkpokọta 29-49-fold na sel HEK293 na 30-79-fold na sel HeLa. 1 µM, ebe nnyefe cytosolic bilitere naanị 7-30-fold na 7-21-fold n'otu n'otu (Na-ewepụ nnyefe cytosolic nke cell na-abanye peptides na ọnụọgụ mgbapụ endosomal., Nkwukọrịta okike, 2021). Uru mkpakọrịta ahụ na-akakarị uru cytosolic, Ya mere nyocha nke na-akọ na ọ bụ naanị mkpokọta mgbama ga-ekwupụta ihe ruru cytosol.

Oghere ahụ bụ ihe nhazi, ọ bụghị teknụzụ. Mkpokọta njikọ cellular na-agụta akpụkpọ anụ, elu-adherent, endosomal, ọdọ mmiri lysosomal na cytosolic ọnụ, na enweghị ike ịmepụta nnyefe n'onwe ya (Nyocha in vitro: ndị enyi ma ọ bụ ndị iro nke peptides na-abanye cell, IJMS, 2020). Ịkpebi ihe ị bu n'obi tụọ na mbụ bụ ihe na-eme ka nhọrọ mgbanwe ndị ọzọ bụrụ eziokwu.

Ntugharị igodo: Kọwaa profaịlụ ngwaahịa e lekwasịrị anya → họrọ klas mgbanwe → ihuenyo paramita ise n'otu n'otu → kwado ụdị ọ bụla gbanwere na nyocha → kọwapụta usoro ndu.. Oge ọ bụla na-amanye nke na-esote.

Ihe usoro a na-eme na anaghị ekpuchi

Na obosara: nhọrọ mgbanwe na nyocha, ihuenyo multi-parameter, na nkwenye nyocha nke ga-ebu ụzọ kọwaa nkọwa ndu ọ bụla. Apụghị oke: ụzọ njikọ na njikọ kemịkalụ, ụlọ ọgwụ dosing, na usoro ntinye akwụkwọ nchịkwa. Nke a bụ ụkpụrụ nke usoro, ọ bụghị a synthes protocol, ma ọ naghị akwado otu klas mgbanwe ọ bụla; nhọrọ ziri ezi dabere na profaịlụ ị debere na Nzọụkwụ 1. Enweghị njikọ dị n'ime maka isiokwu a, yabụ na nkwupụta ọ bụla ebe a ga-abụrịrị na ndị ọgbọ nyochara na nkwughachi isi mmalite ndị e zoro aka na inline.

Nzọụkwụ 1: Kọwaa profaịlụ ngwaahịa ebumnuche tupu ị họrọ mgbanwe ọ bụla

Dee ọnụọgụgụ tupu ị metụ kemistri aka. Profaịlụ ngwaahịa ezubere iche maka CPP emezigharịrị na-edozi paramita ise: nnabata cellular, serum kwụsie ike, usoro nke cytotoxicity, solubility, ma jigidere ọrụ ndu. Onye ọ bụla na-enweta uru ebumnuche, nyocha nke ga-atụ ya, na akara nnabata. Nhọrọ mgbanwe na-agbanwe parampat ndị a megide ibe ha, ya mere profaịlụ nke edere mgbe synthesis bụ ezi uche, ọ bụghị nkọwapụta.

Njikọ ahụ abụghị echiche efu. Iwu imewe maka ụgwọ na hydrophobicity na-ejide na chaja net kwesịrị ịdị mma mana ọ bụghị oke, na Arg na Lys residues na-arụ ọrụ nkesa nke ọma karịa ka etinyere ya n'otu patch cationic siri ike, na amphipathicity kwesịrị ịbụ nke a na-apụghị imeri emeri na njide akpụkpọ anụ kama ikpughe n'ụzọ zuru ezu na mmiri (Akụkọ Sayensị, 2022). Nke ọ bụla n'ime nhọrọ ndị a na-eme ka ị nweta ya, solubility, na imebi akpụkpọ ahụ n'otu oge.

Nke a bụ ya mere na ị nweghị ike ibiri ọnụ ụzọ cytotoxicity site na akwụkwọ ọzọ. Ụyọkọ ọnụ ụzọ akọwara na erughị ala 5 ka 20 µM maka atụmatụ amphipathic ọzọ, na hemolysis na ntapu LDH na-apụtakarị na 5 ka 50 Oke µM, ebe ụfọdụ CPP bara ọgaranya arginine na-egosi enweghị mmetụta MTT ma ọ bụ LDH dị ịrịba ama ruo 100 µM (Akụkọ Sayensị, 2022). Ọnụ ụzọ ewelitere site na ụdị nke nwere mkpado polyfluoroalkyl agwaghị gị ihe ọ bụla gbasara usoro bara ụba arginine., na nke ọzọ.

Profaịlụ arụ ọrụ maka conjugate cytosolic-ebu nwere ike ịgụ: iwelite opekata mpe okpukpu atọ karịa njikwa agwọghị ya site na nyocha cytosolic-access; serum kwụsie ike nke dịkarịa ala 80 peptide emebibeghị na 24 awa; oke cytotoxicity n'elu 50 µM site na mwepụta LDH; solubility nke dịkarịa ala 1 mg/ml na nchekwa physiological; ma ọ dịkarịa ala 70 pasent nke peptide nne na nna na-etinye aka na nyocha ọrụ. Ahịrị ise, ogidi atọ, otu ibe. Dejupụta ya tupu ịtụ ihe ọ bụla.

Ụdị ọdịda ahụ nwere ike ịkọ. Otu dị iche iche na-ebu ụzọ họrọ klaasị mgbanwe, synthesize, chọpụta na kemịkalụ nke doziri iwelite na-efu ha nhịahụ ma ọ bụ kwaba ha n'ime oke mmebi nke akpụkpọ ahụ.. Ka ọ dị mgbe ahụ ahịa-apụ bụ redesign, ọ bụghị mkpebi.

Nzọụkwụ 2: Họrọ klaasị mgbanwe megide profaịlụ

Dakọtara klaasị mgbanwe ọ bụla na oke profaịlụ a na-atụ anya ịkwaga, wee lelee ihe ọ na-efu gị ebe ọzọ. Hydrocarbon stapling na stitching na-azụta nguzogide proteolytic: peptide dị ogologo na-agbatị okpukpu abụọ gbatịpụrụ ọkara ndụ chymotrypsin ya okpukpu 24 ruo 335 nkeji ma nye ọkara ndụ plasma nke awa 1.7, megide analọgụ enweghị stapled nke a na-achọpụtaghị site n'ọnụ ọgụgụ na 4 awa (PNAS, 2010). Na GLP-1 scaffold, Otu staples nyere nguzogide okpukpu 3-13 na nyocha proteinase K yana analọgụ kpara akpa karịa okpukpu 24., na ex-vivo plasma ọkara ndụ na-emewanye okpukpu 12 maka semaglutide na okpukpu 23 maka analọg a kpachie (PMC, 2020). Lipidation na-arụ ọrụ site n'ụzọ dị iche, njikọ nke albumin, na-akpali ọkara ndụ site nkeji ruo ụbọchị: GLP-1 nwa afọ na-ekpochapụ n'ike 1-2 nkeji, liraglutide ruru ihe dị ka 13-15 awa, na semaglutide banyere 165-184 awa (ACS Med Chem Lett, 2018).

Ịgụ tebụl ntụnyere na-agụghị ya karịa

Tebụl bụ maapụ nke azụmaahịa, ọ bụghị ọkwa. Mkpokọta-mgbanwe sitere na peptides nne na nna dị iche iche, protease, na ụdị anaghị agbanwe agbanwe, na mgbanwe nke na-emeri na nkwụsi ike nwere ike ịla n'iyi na solubility ma ọ bụ ọrụ. Onu ogugu nke okpukpu 24 na-achota na otu ihe omumu gp41, yabụ na-ewere ya dị ka nsonaazụ otu scaffold karịa klaasị na-adịgide adịgide.

Nzọụkwụ 3: Ibulite ihuenyo, Nkwụsi ike, Nsi, Solubility, na mmemme ọnụ

Gbaa akwụkwọ ọgụgụ ise niile n'otu ogbe, n'otu nnọkọ, megide analọgụ na-agbanweghị agbanwe dị ka comparator. Kewaa ha n'ofe ogbe ma ọ bụ izu bụ ihe na-emepụta dataset ise ị nweghị ike imekọrịta.

Ihuenyo yiri ya na-ekpuchi:

1. Nweta ma ọ bụ cytosolic, klas nyocha nke ị na-ahọrọ na-ekpebi ihe ị nwere ike ikwu (hụ okpuru).

2. Serum ma ọ bụ protease kwụsie ike, incubate na 37 Celsius C na ọbara, plasma, ma ọ bụ protease akọwapụtara, sample gafee oge ihe, emenyụ na acid (TCA, TFA) ma ọ bụ ihe mgbaze organic (acetonitrile, methanol), centrifuge, wee tụọ peptide na iberibe RP-HPLC/UPLC ma ọ bụ LC-MS wee nweta ọkara ndụ site n'usoro ire ere. (J Pept Sci, 2024). Gụnye njikwa oge-efu emechara n'otu aka ahụ, ma mee ihe analọgụ na-agbanweghị agbanwe n'otu aka ahụ.

3. Viability na akpụkpọ ahụ iguzosi ike n'ezi ihe, mgbanwe nke na-eme ka nkwalite cellular CPP dịkwuo elu na nkwụsi ike mgbe ị na-edina akpụkpọ ahụ abụghị nkwalite.

4. Solubility na nchịkọta, lelee na nyocha ịta ahụhụ, ọ bụghị na ngwaahịa ịta.

5. Ọrụ arụrụ arụ, agụpụta mgbanwe ahụ kwesịrị ịrụ ọrụ.

Ihe mere a ga-eji mee ka ọ dị mma megide mkpokọta mkpokọta bụ na mgbanarị arụmọrụ na iwelite abụghị otu nha. Na ntụnyere SLEEQ n'akụkụ n'akụkụ, Ọ dịghị otu n'ime peptides na-abanye n'ime cell nwalere ma ọ bụ na-agbanarị peptides nke enwetara arụmọrụ mgbanarị endosomal dị elu karịa GFP naanị otu oge jikọtara ọnụ.; Ọtụtụ peptides akwụ ụgwọ nke ọma gosipụtara otu arụmọrụ ma ọ bụ dị ala. Ebe mgbapụ GFP dị n'okpuru 2% na sel HEK293 na ihe dị ka 7% na sel HeLa (Nkwukọrịta okike, 2021). Otu peptide nke na-ele anya ka ọ dị elu na nnukwu ọgụgụ nwere ike ịdị na ya n'ọtụtụ buru ibu.

Ịhọrọ cytosolic-access assay kama ị nweta nnukwu nyocha

Klas nyocha abụọ na-aza ajụjụ dị iche iche, na naanị otu n'ime ha na-akwado nkwupụta nnyefe.

Nnukwu fluorescence na-akọ mkpokọta mgbama metụtara cell: peptide na-ejikọta na akpụkpọ ahụ, tọrọ atọ na endosomes, na n'ezie na cytosol, chịkọtara ọnụ. Ọ na-adị ngwa ngwa, ọnụ ala, yana zuru oke dị ka ihe nleba anya iji wepụta ndị ga-eme ntuli aka ma ọ bụ tụọ otu ogbe dara ada. Ọ bụghị ihe akaebe nke nnyefe, na ịgwọ ya dị ka nke a bụ njehie nkọwa a na-ahụkarị na nzọụkwụ a.

Nyocha cytosolic-nweta chọrọ peptide ahụ iru cytosol iji mepụta mgbaàmà ma ọlị. Nkewa-GFP mmeju, nnyefe ọrụ Cre-lox, nyocha nke penetration chloroalkane (CAPA), na ndị nta akụkọ endosomal-escape niile dabara na klas a (IJMS, 2020). Onye ọ bụla chọrọ njikwa nke ya: ụzọ mmeju na-enweghị ike ịgbakọta extracellular, ahịrị cell onye nta akụkọ Cre nwere njikwa adịghị mma enwetara, na usoro ntinye uche nke na-anọ n'okpuru ebe mgbagha akpụkpọ ahụ.

Peptide Synthesis Jiri nnukwu fluorescence kpebie ndị ga-aga n'ihu. Jiri nyocha nnweta cytosolic iji kpebie ma ọ bụla n'ime ha ewepụtara.

Nzọụkwụ 4: Gosipụta ụdịdị ọ bụla emezigharịrị nke ọma tupu ịsụgharị usoro ndu ndu

Mmeghachi omume mgbanwe anaghị emepụta otu molekul. Ọ na-emepụta ngwakọta, na conjugate ezubere bụ naanị otu akụkụ ya. Tupu atụkwasị nọmba mbuli ma ọ bụ mmemme ọ bụla, na conjugate ga-egosi na ọ dị, na nri fọdụrụnụ, na ịdị ọcha nke ị na-ekwu. Usoro nkwenye maka njirimara nyocha mgbanwe peptide bụ maapụ LC-MS/MS peptide dị ala., na-agba ọsọ ugboro ugboro dị ka nlebanya ọtụtụ àgwà: ezi-oke emebibeghị-oke nkwenye ngbanwe a na-atụ anya ya, chromatographic ịdị ọcha ntule, na saịtị-ịkpọsa MS/MS (Na-agagharị ihe ịma aka na nyocha spectrometry mass nke mgbanwe protein endogenous na sịntetik, 2026). MS emebibeghị na-egosi na ngbanwe oke a tụrụ anya mere; maapụ peptide na-eguzobe ebe ọ mere; LC/EIC na-ekewa gbanwetụrụ na ụdị anaghị agbanwe agbanwe; Oge njigide dị iche iche jikọtara ya na ụkpụrụ MS/MS na-ekpughe isomers ọnọdụ na ngwaahịa mgbanwe akụkụ, na otu workflow na-ekenye deamidation na oxidation n'akụkụ ngwaahịa.

Pasent dị ọcha abụghị ihe akaebe ahụ. A na-ere peptides sịntetik emebere HPLC n'ụzọ siri ike 90 ka 99% ịdị ọcha ka nwere ike iburu usoro nhichapụ, truncations, ụdị echedoro ezughị oke, ngwaahịa oxidized ma ọ bụ deamidated, na isomers ọnọdụ ma ọ bụ epimers na-akwado ma ọ bụ gbanarị nkwenye MS oge niile (peptide-edu akwụkwọ, 2026). Asambodo na-akọ ihe kọlụm ahụ kpebiri, ọ bụghị ihe ogbe nwere.

Ndepụta nkwenye maka ụdị agbanweela

Gbaa nkwenye ụdị peptide gbanwetụrụ dị ka usoro a kapịrị ọnụ karịa usoro ịgbanye ad hoc. Ọka na-adịghị mma dabara ngbanwe a tụrụ anya ya. Maapụ Peptide na-emezigharị mgbanwe ahụ ka ọ bụrụ ihe fọdụrụ echere. Ọ nweghị isomer ọnọdụ na-emekọrịta ihe na-anọdụ n'elu ebe mkpesa. A na-agụta ngwaahịa ndị na-agbanwe akụkụ na ndị nne na-emezigharị. A na-agbakọ ngwaahịa oxidation na deamidation. A na-enyocha mkpokọta na ọdịnaya enweghị mgbaze. Mgbe ahụ kwugharịa nke ọ bụla n'ime nlele ndị ahụ ka nkwụsi ike ọ bụla gasịrị, n'ihi na ebe kacha elu HPLC naanị enweghị ike igosipụta mgbanwe ọ dịlarịrị: ma ọ bụrụ na mgbanwe bụ chemically labile, A ga-enyocharịrị LC-MS/MS mgbe emechara ihe fọdụrụ ma ọ bụ mkpado gbanwetụrụ, ebe ọ bụ na ọkpụkpụ azụ fọdụrụnụ nwere nnukwu mgbanwe ma ọ bụ ion na-efunahụ mgbanwe pụtara na mgbanwe ahụ efunahụla. (LC-MS/MS maapụ mmebi iwu, 2010).

Nzọụkwụ 5: Tụgharịa asụsụ data ahụ na-enweghị mkpakọrịta na-agbagwoju anya na nnyefe

ịrị elu mgbaama abụghị ihe akaebe nke nnyefe ruo mgbe ị kwụsịrị ijikọ, ọnyà, na mmepụta ihe arịa. Hazie nha cytosolic ọ bụla iji kwekọọ mkpokọta mkpokọta, nke mere na a gaghị agụ mgbanwe ole peptide dị ka mgbanwe ebe ọ gara. Kpachapụ ma ọ bụ menyụọ peptide dị n'elu tupu ịkpọọ mgbaama fọdụrụ n'ime.

Cationic peptides na-ejikọta akpụkpọ ahụ dị n'elu nke ọma, ọ bụ ya mere a ga-eji chọọ iwepụ trypsin ma ọ bụ menyụọ fluorophore dị n'èzí tupu enwee ike ịsị na mgbama bụ iwelite. (Usoro nke nnabata cellular nke peptides na-abanye cell, 2011). Otu ebe katalọgụ ụzọ ndị ọzọ nkọwa a si aga na-ezighi ezi: ndozi na-ekepụta akụrụngwa intracellular ma ọ bụ mpaghara nuklia, karịsịa maka CPP cationic; Ọnyà endosomal na-agụhieghị dịka nnyefe cytosolic; na nleba anya dabere na ọdịiche dị n'etiti fluorescence spectroscopy, cytometry eruba, na confocal microscope, karịsịa maka usoro amphipathic na Trp-ọgaranya. Nkwadebe cell, ọbara, okpomọkụ, mgbasa ozi, na ahịrị cell na-agbakwunye mgbanwe ọzọ, ya mere a pụta na-adịghị mụta nwa gafee ụbọchị ekwesịghị iburu a nnyefe nzọrọ.

Nchịkọta bụ ọnyà nke abụọ. Ihe na-esighi ike na-arapara na sel ma ọ bụ na-ebuli ya na-enweghị isi, na-emepụta ntinye pụtara ìhè nke bụ ihe mmepụta ihe karịa ihe onwunwe nke peptide (Enwere ike CPP na ihe ịma aka, 2016). Chịkọta ma ọ bụ centrifuge ngwọta na-arụ ọrụ wee lelee ya site na microscopy tupu ịkọwa data iwelite ọ bụla. Nke a bụkwa ebe nnabata cellular CPP na nkwụsi ike ịgụ akwụkwọ na-agbanwe: peptide kwụsiri ike nke na-ebuli n'okpuru ọnọdụ nyocha ga-adị ka ọ banye n'ime. Mmepụta Peptide

Mesoo ọnyà endosomal dị ka ihe pụrụ iche, ọ bụghị ihe ịga nke ọma nke ọma. Otu peptide ruru endosome erubeghị cytosol, na ha abụọ chọrọ ọrụ nleba anya dị iche iche.

Mmejọ ndị a na-ahụkarị na Mgbanwe Peptide na-abanye cell

Ọtụtụ ọdịda imewe peptide na-abanye n'ime cell abụghị ihe mberede nnwale. Ha bụ njehie nkọwa na-adị ndụ n'ihi na data ahụ dị ọcha.

Na-emeso mgbanwe ahụ dị ka mgbakwunye karịa ihe ọhụrụ. Pentide jikọtara ọnụ bụ molekul dị iche nwere ụgwọ dị iche iche, nha, na omume mkpokọta. Otu ndị na-edobe ọnọdụ nyocha nke peptide nne na nna, solubility echiche, na dosing rationale na-atụ ihe ha na-ebughị n'obi ime. Weghachite nleba anya na-arụ ọrụ na nchekwa site na akụrụngwa nke conjugate.

Na-akọ otu agụmagụ iwelite dị ka nnyefe. Otu nọmba fluorescence enweghị ike ikewapụ njikọ nke akpụkpọ ahụ na ohere cytosolic. Na-enweghị nkebi-edozi nyocha, mgbama dị elu kwekọrọ na mgbasa ozi elu. Jikọta nkwupụta mbuli ọ bụla na njikwa mpaghara.

Ịnabata pasentị ịdị ọcha dị ka nkwenye ụdị. A 95% Nsonaazụ HPLC na-ekwu na ọnụ ọgụgụ kachasị elu na-achịkwa site na nnabata UV. Ọ naghị ekwu na ọnụ ọgụgụ kasị elu bụ conjugate gị bu n'obi kama ịbụ isomer ọnọdụ ma ọ bụ ngwaahịa gbanwetụrụ.. Ịdị ọcha na njirimara bụ nha dị iche iche.

Na-agbaziri ọnụ ụzọ cytotoxicity site na nyocha ọzọ na ahịrị cell. Mgbagha nke membrane na-adabere na peptide, ntinye uche, na a na-enyocha ihe mejupụtara akpụkpọ ahụ. Usoro anabatara n'otu sistemu anaghị ebufe ọzọ.

Iche na arginine ọzọ pụtara nnyefe ọzọ. Otu agbakwunyere dị mkpa dịka ụgwọ. d(X)Analọg TAT emeghị ka plasma-membrane ma ọ bụ mmalite-endosome liposomes ma ọlị, ma na-emebi emebi liposomes mbubreyo na pH 5.5, na ntapu na-enyocha hydrophobicity nke X karịa ọdịnaya arginine (Hydrophobicity bụ isi ihe na-achọpụta ọrụ nke arginine nwere ụbara cell na-abanye n'ime peptides, Akụkọ Sayensị, 2022).

Ịdọ aka ná ntị: Ọnụọgụ Arginine anaghị ebu amụma maka mmebi. N'ime d(X)Usoro TAT, ntapu jikọtara ya na hydrophobicity nke otu agbakwunyere, na enweghị permeabilization mere na plasma-membrane ma ọ bụ mmalite-endosome pH n'agbanyeghị ọdịnaya arginine..

Ụdị ọdịda: mgbanwe nke na-adịghị na peptide

Ụdị ụkpụrụ a kacha emebi emebi bụ mfu nkịtị. Enwere ike kụwaa mkpado ma ọ bụ mgbanwe labile n'oge nnabata ma ọ bụ njikwa, na-ahapụ mgbama ọkpụkpụ azụ nke ka na-agụ dị ka njikọ na-adịghị emebi emebi. Nnwale ahụ na-akọ peptide, ma ọ bụghị peptide ị mere.

Ndozi bụ iji kwado ụdị ahụ mgbe ntinyechara ya, ọ bụghị naanị tupu ya. Nlebanya LC-MS/MS nbipute ga-egosi ma mgbanwe a ka etinyere n'ọkpụkpụ azụ n'oge ewepụtara ihe ọmụmụ ihe ọmụmụ.. Ọ bụrụ na ọ bụghị, Nsonaazụ na-akọwa peptide na-enweghị njikọ, na nkwubi okwu ọ bụla gbasara ntinye mgbanwe ahụ akwadoghị.

Kedu ihe ịga nke ọma dị ka

Mgbasa ngbanwe nke nwere ike ịgbachitere ejedebe na ihe ise, ọ bụghị otu nsonaazụ. Profaịlụ ngwaahịa ezubere iche na-ebu njirisi nnabata ọnụọgụ maka paramita ise ọ bụla. A na-ahọrọ klas mgbanwe megide ise niile ọnụ, ọ bụghị megide iwere naanị ya. Ihuenyo ahụ yiri ya na-agba n'otu batch nwere ihe ngbanwe agbanwebeghị n'akụkụ ya. Ndepụta ụdịdị a kwadoro na-agụta isomers ọnọdụ, ngwaahịa mgbanwe akụkụ, na oxidation ma ọ bụ deamidation ngwaahịa kama ịkọ ha na-anọghị. Mkpesa nnyefe ahụ dabere na nyocha cytosolic-accessay yana mkpokọta jikọtara ọnụ, ya mere enwere ike ịgụ nọmba abụọ ahụ megide ibe ha.

Maka ndụmọdụ: Gbatịkwuo usoro ọrụ nkwenye n'ime usoro oge nkwụsi ike. Mgbanwe mgbanwe ka oge na-aga bụ nke a na-atụtu ọnụ, ma na-eche na ọ bụ ka dataset ntọhapụ dị ọcha ga-esi bụrụ ike na-enweghị nkọwa ka ọnwa isii gachara..

Ndepụta ụdịdị na nkwupụta nnyefe nke mkpakọrịta bụ akụkụ abụọ onye nyocha ga-ebu ụzọ nwalee, n'ihi na ha bụ abụọ na-enweghị ike wughachi mgbe eziokwu.

Nnwale njikwa mma na mwepụta maka Peptides agbanweela

Nnwale mwepụta na-anọdụ n'ụdị dị iche site na usoro nkwenye ọkwa ọkwa nyocha. Nsonaazụ sterility na nje nje endotoxin bụ ọkwa ngafe ma ọ bụ daa: ha na-akọwa nza dị n'ihu gị, ọ bụghị peptide imewe, na ha anaghị ebuga na-esote ogbe.

Maka ịmụ nwa, USP <71> Nnwale ịmụ nwa chọrọ incubation na Fluid Thioglycollate Medium na 30-35 Celsius C maka anaerobes na Soybean-Casein Digest Medium na 20-25 Celsius C maka aerobes na fungi., ejidere ma ọ dịkarịa ala 14 ụbọchị. Nzacha mkpụrụ ndụ na 0.45 µm ma ọ bụ nke kacha mma bụ usoro kachasị mma, na inoculation ozugbo dị ka ihe ọzọ, na njirisi nnabata abụghị ihe akaebe nke uto microbial mgbe oge incubation gasịrị. Maka endotoxins, USP <85> Nnwale Endotoxins nke nje na-akọwapụta nsonaazụ ya n'ọnụ ọgụgụ na EU/mL ma ọ bụ EU/mg na-eji gel-clot, turbidimetric, ma ọ bụ usoro chromogenic, na oke parenteral nkịtị gbakọrọ ka K kewara site na M, ebe K 5 EU/kg maka ọtụtụ ụzọ na 0.2 EU / kg maka nchịkwa intrathecal.

Dakọtara usoro nyocha na mkpebi ọ na-akwado

Usoro na-ewepụta ogbe na usoro na-atụnyere analogs nyocha abụọ anaghị ebu otu ibu nkwado. I Q2(R2) chọrọ usoro ntọhapụ ma ọ bụ nkwụsi ike ka egosipụtara dabara adaba maka iji ya eme ihe, na njirimara nkwado ahọpụtara dịka ebumnuche nke usoro na nyocha. Ụkpụrụ ahụ nwere nsonaazụ bara uru maka njirimara nyocha mgbanwe peptide: A naghị akwado usoro akwadoro maka njirimara na-akpaghị aka maka ọnụọgụ adịghị ọcha. Nkọwapụta na-abụkarị akụkụ siri ike maka peptides gbanwetụrụ, na igosipụta enweghị nnyonye anya nwere ike ịchọ usoro orthogonal.

Ajụjụ a na-ajụkarị

Ogologo oge ole ka ihuenyo mgbanwe na-ewe?

Enweghị otu nọmba, n'ihi na mgbanwe atọ na-achịkwa usoro iheomume. Nke mbụ bụ ole analogs ị na-eme na agba nke mbụ: nyocha Analog ise nke otu klaasị mgbanwe na-aga ngwa ngwa karịa matriks nke gafere klas abụọ nwere ụdị ọnọdụ atọ ọ bụla.. Nke abụọ bụ ma cytosolic-access assay adịlarị na ụlọ nyocha gị ma ọ bụ na a ga-edozi ya ma tozuo site na mmalite., nke na-abụkarị otu ihe kachasị ogologo na ụzọ dị oke egwu. Nke atọ bụ ka ị na-agba ọsọ kwụsie ike: otu oge na-aza ajụjụ dị warara ngwa ngwa, ebe usoro ire ere zuru oke nke nwere isi ihe zuru oke iji kwado ọnụego chọrọ nlele na nyocha ugboro ugboro. Debe atọ ndị ahụ tupu i kwe nkwa ụbọchị.

Enwere m ike iji nnukwu nyocha nke fluorescence kama iji nyocha cytosolic-access?

Dị ka ihe nzacha nyocha, ee. Dị ka ihe àmà nke nnyefe, mba. Otu nnukwu fluorescence readout na-akọ mkpokọta mgbama metụtara cell, nke na-ejikọta peptide na akpụkpọ ahụ, peptide tọrọ atọ na endosomes, na peptide nke ruru cytosol n'ezie. N'ihi na ọnụ ọgụgụ ndị ahụ enweghị ike ịmata na nnukwu mgbama, Enwere ike ịmepụta ọgụgụ dị elu kpamkpam site na ijikọta elu. Jiri nnukwu fluorescence iji nweta ọkwa na mbelata analọg, wee kwado ndị lanarịrịnụ jiri nyocha nke na-ekewa ohere cytosolic na mkpokọta mkpokọta.

Gịnị ma ọ bụrụ na m gbanwetụrụ mkpokọta peptide?

Were mkpokọta dị ka ihe eji arụ ọrụ ruo mgbe ị kwụsịrị ya. Centrifuge ma ọ bụ yochaa nlele ahụ, wee tụgharịa itinye uche site na usoro nke nọọrọ onwe ya, ebe ọ bụ na ntinye uche nke a na-ewere na ngwọta turbid ga-ekwupụta ihe bụ n'ezie na ngwọta. Nyochaa ihe a site na microscope iji gosi ma mkpokọta dị yana otu ha si akpa agwa. Naanị mgbe ahụ megharịa nyocha nke nleba anya na akụkụ ahụ akọwapụtara. Nkwubi na ngbanwe na-eme ka nnabata dị mma ebe mgbama sitere na ihe ekpokọtara bụ otu n'ime njehie nkọwa na-adịkarị na usoro ọrụ a..

Kedu ka m ga-esi mara na mgbanwe ahụ ka dị na peptide ka emechara ya?

Lelee maka mgbanwe n'onwe ya, ọ bụghị naanị oke nne na nna. Gbaa LC-MS/MS na nlele nlegharị anya mgbe emechara wee lelee ya maka ihe fọdụrụ ma ọ bụ mkpado gbanwetụrụ.: ion iberibe mgbanwe-kpọmkwem, ma ọ bụ nnukwu mgbanwe nke mgbanwe ahụ na-enye. Ọ bụrụ na oke agbanweela azụ n'ebe nne na nna agbanwebeghị, ma ọ bụ ọ bụrụ na ion ndị na-achọpụta mgbanwe na-efu, mgbanwe ahụ furu efu n'oge incubation. Naanị egwuregwu nne na nna anaghị egosi na mgbanwe ahụ dịgidere.

Bụ a 95% Nsonaazụ ịdị ọcha HPLC zuru oke iji kwado ụdị m gbanwetụrụ?

Mba. Ọnụ ọgụgụ ịdị ọcha nke otu ụzọ na-agwa gị ego ole a gbapụtara n'otu ọnụ ọgụgụ dị elu n'okpuru otu ọnọdụ; ọ naghị agwa gị ihe ọnụ ọgụgụ ahụ nwere. Pasent ole na ole fọdụrụ nwere ike ịgụnye usoro ihichapụ, ngwaahịa agbaji, na oxidation ma ọ bụ deamidation n'akụkụ ngwaahịa, na isomers ọnọdụ nke otu mgbanwe nwere ike imekọrịta ihe na ebumnuche n'okpuru otu gradient. Were nọmba ịdị ọcha dị ka nkọwa ntọhapụ, ọ bụghị dị ka structural nkwenye. Nkọwapụta orthogonal bụ ihe na-egosi na ụdị ị haziri bụ ụdị ị nwere.

Nzọụkwụ ọzọ

Ị jidezi profaịlụ ngwaahịa ebumnuche nwere oke ise, klas mgbanwe ahọpụtara megide paramita ise niile, na ngwa ahịa ụdị enwetara. Echiche nke usoro ahụ bụ nke a na-ewepụ: nkwupụta nnyefe siri ike dị ka nyocha cytosolic-access assay n'azụ ya yana mkpokọta mkpokọta dabara na ya tụrụ n'akụkụ ya..

Ọ bụrụ na ọrụ nkwenye ahụ gbasara ikike karịa otu ụlọ nyocha na-ejide n'ọtụtụ nyocha, Nlebanya ime mgbanwe nwere ike ịdepụta usoro nke ga-anọ n'ụlọ yana nke chọrọ onye mmekọ mpụga. MOL Mgbanwe na-enye njikọ peptide na ọrụ mgbanwe yana QC nyocha gụnyere HPLC na MS, ma na-akwado mmepụta gburugburu ebe obibi adịghị mma, nke na-ekpuchi akụkụ nke usoro nkwenye ụdị peptide gbanwetụrụ.

Nkpughe: MOL Mgbanwe nwere mmasị azụmahịa na ụkpụrụ mma peptide.

Rịọ maka nyocha mgbanwe mgbanwe