Domande frequenti
Semplicemente al complesso da milligrammi a chilogrammi
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How to store peptides?
Peptidi liofilizzati
Per la conservazione a lungo termine dei peptidi, si consiglia di conservarli sotto forma di polvere solida. I peptidi liofilizzati possono essere conservati a -20°C o a temperature inferiori con una degradazione minima. Si consiglia ai clienti di ispezionare nuovamente i peptidi personalizzati ogni 2 anni dalla data di rilascio del controllo qualità.
Peptidi in soluzione
I peptidi in soluzione sono meno stabili e soggetti a degradazione. Le soluzioni acquose utilizzate per dissolvere i peptidi devono essere sterili e pure.
In soluzione, una certa quantità di peptide può essere degradata, a seconda degli aminoacidi presenti nella sequenza. Alcuni esempi sono elencati di seguito:
– Peptidi contenenti metionina, I residui di cisteina o triptofano dovrebbero avere un tempo di conservazione limitato in soluzione a causa dell'ossidazione. Questi peptidi dovrebbero essere sciolti in un solvente privo di ossigeno. –
La glutammina e l'asparagina possono essere deamidate in acido glutammico e acido aspartico, rispettivamente. –
La cisteina può subire ciclizzazione ossidativa per formare un legame disolfuro cisteina-cisteina (che possono formarsi all'interno o tra i legami disolfuro). –
I residui carichi (acido aspartico, acido glutammico, lisina, arginina, istidina) sono igroscopici (assorbendo acqua dall'aria) e tendono a formare un viscoso, olio limpido. Questo cambiamento fisico potrebbe non influenzare la natura del peptide. Si raccomanda che tali peptidi vengano liofilizzati per rimuovere tracce di acqua, quindi degassato con azoto per garantire che non vi sia vapore acqueo nella fiala, e poi rapidamente tappato.
Per evitare danni dovuti a ripetuti congelamenti e scongelamenti, consigliamo agli utenti di sciogliere solo la quantità di peptide necessaria per l'esperimento corrente. La soluzione in eccesso deve essere conservata a ≥ -20 o C fino al momento del bisogno.
Evitare l'umidità.
Poiché l'umidità riduce significativamente la stabilità a lungo termine dei peptidi, si consiglia di equilibrare i peptidi in un essiccatore a temperatura ambiente prima di aprire le fiale. Al termine della dispensazione del peptide, i restanti peptidi nella provetta devono essere delicatamente spurgati con azoto anidro, quindi il contenitore dovrebbe essere tappato, sigillato con una pellicola sigillante, e conservato a -20°C.
Le caratteristiche di solubilità dei diversi peptidi variano considerevolmente. Residui come l'alanina (Ala), cisteina (Cis), isoleucina (Con), leucina (Leu), metionina (Incontrato), fenilalanina (Fe), e valina (Val) si aggiungono all’idrofobicità e alla solubilità del peptide in soluzioni acquose, e si consiglia al cliente di seguire queste linee guida durante la personalizzazione dei peptidi.
Proprietà di solubilità
La solubilità dei peptidi dipende fortemente dalla sequenza aminoacidica. Peptidi naturalmente idrofobici (UN, F, G, V, l, IO, M, W, P con maggiore propensione) richiedono solventi organici per la solubilizzazione. Peptidi acidi (maggiore propensione per D, E nella sequenza peptidica) richiedono tamponi acquosi basici per la solubilizzazione, mentre i peptidi basici (maggiore propensione per K, H, e R) richiedono tamponi acquosi acidi per la solubilizzazione.
Selezione del solvente
Considerati i limiti del tuo test, si consiglia di utilizzare le seguenti linee guida per determinare il miglior solvente per la solubilizzazione dei peptidi
Peptidi idrofobici
Per risolubilizzare i peptidi idrofobici, aggiungere 100 µ l di DMSO e sonicare fino alla formazione di una soluzione omogenea. Prossimo, aggiungi il buffer di tua scelta per creare un file 1 soluzione mg/ml (maggiore è la concentrazione del peptide, maggiore è la quantità di DMSO richiesta).
Idrofilo (Acido) Peptidi
Per risolubilizzare i peptidi acidi, aggiungere 100 µl di 1% NH 4 OH a 1 mg di peptide e vortice. Una volta che la soluzione è chiara, aggiungi il buffer di tua scelta per creare un file 1 soluzione mg/ml.
Idrofilo (Di base) Peptidi
Per ricostituire un peptide basico, aggiungere acqua distillata 1 mg di peptide e vortice.
Qual è la differenza tra il peso netto e quello lordo del peptide?
Lo standard industriale è fornire i peptidi in forma liofilizzata come peso lordo. Peso lordo del peptide è il peso totale di tutti i componenti presenti nella polvere liofilizzata. Ciò include il peptide di interesse, eventuali impurità peptidiche, acqua, solventi residui, e controione.
Al contrario Netto peso del peptide, calcolato da Contenuto netto di peptidi, è il peso di solo il peptide componente presente nella polvere liofilizzata. Ciò offre concentrazioni più accurate delle successive soluzioni peptidiche. Quindi, per i quali abbiamo consigliato le quantità di peso netto dei peptidi Peptide personalizzato ordini.
Contenuto netto di peptidi la misurazione viene eseguita mediante analisi degli amminoacidi (AAA; precisione limitata ma richiede una bassa quantità di materiale) o analisi elementare (CHN; richiede milligrammi di peptide ma è più accurato). Entrambi i metodi producono un valore percentuale (cioè., 75% contenuto netto di peptidi).
Il contenuto netto di peptidi dipende dalla quantità di controione presente*, che dipende dalla sequenza peptidica. Essenzialmente, maggiore è la carica peptidica, minore è il contenuto di peptidi
*Nota: L'elemento utilizzato per calcolare il contenuto netto di peptidi si basa sul controione peptidico. Questo viene fatto per garantire che il controione non contribuisca alla quantità di contenuto peptidico. Per esempio, quando TFA o acetato sono il controione, l'azoto viene utilizzato perché si trova nel peptide ma non nel TFA o nell'acetato. È possibile utilizzare carbonio o azoto quando il cloruro è il controione per lo stesso motivo.
Calcoli del peso netto del peptide:
Quantità netta di peptidi (peptide totale) — metodo che utilizziamo per gli ordini netti di peptidi personalizzati.
Moltiplicare la percentuale di contenuto netto di peptidi (forma decimale) dal peso lordo del peptide, per ottenere la quantità di quantità netta di peptidi (peptide totale).
Per esempio:
Per 5 mg di peptide lordo/fiala:
Il contenuto netto dei peptidi è 84%.
Quantità esatta di peptide totale = 0.84*5 mg=4,2 mg di peptide totale
Quantità netta di peptidi di interesse: la massima precisione — il cliente può utilizzare questo metodo da solo per calcolare il peptide di interesse.
Moltiplicare la percentuale di contenuto netto di peptidi per il peso lordo del peptide, e la purezza del peptide (mediante HPLC), per calcolare la quantità esatta del peptide di interesse che hai. La percentuale netta di peptidi (forma decimale) è moltiplicato per la purezza del peptide (forma decimale).
Per esempio:
Per 5 mg di peptide lordo/fiala con:
Il contenuto netto dei peptidi è 84%.
La quantità esatta del peptide di interesse è = 0.84*0.96*5 mg=4,03 mg
MOL Changes utilizza la chimica Fmoc in fase solida anziché la chimica BOC. La chimica Fmoc consente la rimozione dei gruppi protettivi utilizzando condizioni blande durante l'allungamento del peptide, mentre la chimica BOC richiede l'uso di un acido forte per rimuovere i gruppi protettivi durante l'allungamento del peptide. Inoltre, La chimica Fmoc utilizza l'acido trifluoroacetico (TFA) per rimuovere il peptide dalla resina, mentre la chimica BOC utilizza l'acido fluoridrico (HF). L'HF è incolore, altamente corrosivo, e un veleno per contatti.
Perciò, MOL Changes utilizza la chimica Fmoc poiché è più delicata, flessibile, e versatile rispetto alla chimica BOC.
Come calcolo la molarità del mio peptide?
La molarità si riferisce alla concentrazione molare di una soluzione, che è il numero di moli di soluto disciolte 1 litro di soluzione, espresso in mol/L, o M.
Molarità [M] = Messa / (Volume x Massa Molare); Talpa = Concentrazione (g/l) x volume (l)/MW (g/mol)
Esempio:
Dato: 1mg di polvere peptidica secca con PM: 20KDa (La massa molare del peptide è 20 g/mol)
Determinare la molarità con massa e volume noti
Per una soluzione da 1 ml di questo peptide:
Molarità = Massa (0.001G) / (volume (0.001l) x Massa Molare (MW 20,000) = 50 µM
Determinare la massa per raggiungere una certa molarità:
Se per il tuo test, è necessaria una soluzione peptidica funzionante da 0,01 mM in 1 ml di acqua, quindi calcolare la massa richiesta come segue:
Massa = Molarità x Volume x Massa Molare
Massa = 0,01 mMx (1/1000 l) x 20.000 g/mol = 0,0002 g
Quindi, avrai bisogno di 0,2 mg/ml di peptide per avere una soluzione funzionante di 0,01 mM.
In quale forma vengono consegnati i peptidi?
Forniamo soluzioni in polvere e peptidi liofilizzate o grezze.
Come faccio a sapere se il mio peptide sarà solubile?
La solubilità di un peptide in un dato solvente dipende dalla sequenza aminoacidica ed è spesso difficile da prevedere. Nel caso dei peptidi del catalogo, le informazioni sulla solubilità sono elencate nella scheda tecnica del QC. Per peptidi personalizzati, si prega di consultare la sezione intitolata “Come dovrei solubilizzare il mio peptide”.
Qual è la differenza tra contenuto di peptidi e purezza dei peptidi?
Il contenuto di peptidi non è un'indicazione della purezza del peptide poiché si tratta di due misurazioni separate. La purezza è determinata mediante HPLC analitico e indica la presenza/assenza di altri contaminanti peptidici (i.e. peptidi troncati).
Il contenuto netto di peptidi determina la quantità effettiva del peptide (peptide di interesse così come i contaminanti peptidici) presente nel campione. Il contenuto netto di peptidi viene tradizionalmente misurato mediante analisi degli amminoacidi (AAA; precisione limitata ma richiede una bassa quantità di materiale) o analisi elementare (CHN; richiede milligrammi di peptide ma è più accurato).
Come purificate generalmente i vostri peptidi??
I peptidi MOL Changes vengono generalmente purificati mediante HPLC preparativa in fase inversa, utilizzando 2 buffer contenenti 0.1% acido trifluoroacetico (TFA). Il primo tampone (Buffer A) è composto da 0.1 % TFA in acqua deionizzata e il secondo tampone (Buffer B) è composto da 0.1 % TFA in acetonitrile (ACN).
Generalmente, i peptidi grezzi vengono prima sciolti in una soluzione del tampone A, una certa quantità di Buffer B, o un solvente organico polare come DMSO. Se è stato utilizzato un solvente organico polare o il tampone B, questa soluzione limpida verrà prima diluita con il tampone A. Prossimo, la soluzione peptidica viene filtrata e caricata nel sistema HPLC preparativo. Utilizzando un gradiente di metodo ottimizzato, le frazioni vengono quindi raccolte in base alle letture di assorbanza. Ciascuna frazione viene quindi analizzata tramite un HPLC analitico per garantire che la purezza di ciascuna frazione soddisfi le specifiche di purezza richieste.
Queste frazioni “pure” vengono poi riunite e liofilizzate. La polvere “pura” viene quindi testata sia per la purezza che per l'identità per garantire che sia stato prodotto il peptide corretto.
Finalmente, un gruppo di controllo qualità indipendente presso AnaSpec testa nuovamente il peptide per garantire che tutti gli attributi del test soddisfino le specifiche richieste.
Come scrivo i termini della mia sequenza peptidica?
La nomenclatura internazionale utilizzata per i termini della sequenza è la seguente:
– N-terminale: H significa ammina libera (NH2-), Ac significa acetile [CH3C(O)-NH-], Pyr significa acido piroglutammico
– Terminale C: OH significa acido libero (-COOH), NH2 significa ammide [-CONH2]
– Le modifiche sulla catena laterale degli amminoacidi sono rappresentate tra parentesi dopo l'amminoacido corrispondente. Per esempio; serina fosforilata = S(PO3H2) o lisina epsilon-N-acetilata = K(Ac)
Cos'è un controione peptidico?
Durante la produzione del peptide, gli ioni nelle soluzioni di sintesi e purificazione si legano alle catene laterali di amminoacidi carichi del peptide, formando sali. Questi ioni sono noti come controioni peptidici e aiutano a bilanciare la carica del peptide.
Acido trifluoroacetico (TFA) è comunemente usato nella sintesi e purificazione dei peptidi.
Forma sali trifluoroacetati con aminoacidi basici (per esempio., lisina, arginina, istidina) e l'ammina N-terminale libera. Perciò, il trifluoroacetato è tipicamente il controione predefinito.
Il numero minimo di molecole di TFA legate ad un peptide è proporzionale al numero di residui basici in una data sequenza peptidica. Così, i residui più basici presenti in un peptide, minore è il contenuto netto di peptidi della polvere liofilizzata. Per tenere conto del contenuto di TFA o acqua presente nel campione, si consiglia di eseguire un'analisi del contenuto peptidico per ogni peptide personalizzato.
Acqua e acido trifluoroacetico (TFA) sono sottoprodotti del processo di depurazione. Tuttavia, Il TFA può sollevare problemi di tossicità per in vivo e studi preclinici. Perciò, MOL Changes offre acetato non tossico, cloruro, o scambiatori di sali di ammonio.
hy sono peptidi contenenti Cys, Incontrato, o Trp difficile da sintetizzare?
Peptidi contenenti Cys, Incontrato, o Trp sono difficili da sintetizzare e ottenere prodotti di elevata purezza. Ciò è dovuto principalmente all'instabilità e alla suscettibilità all'ossidazione di questi gruppi funzionali. È richiesta particolare attenzione per l'uso e la conservazione di questi peptidi per evitare l'apertura ripetuta delle fiale.
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