Preguntas frecuentes
Simplemente para complejar de miligramos a kilogramos
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How to store peptides?
Péptidos liofilizados
Para el almacenamiento a largo plazo de péptidos., Recomendamos almacenarlos como un polvo sólido.. Los péptidos liofilizados se pueden almacenar a -20 °C o menos con una degradación mínima.. Se recomienda a los clientes que vuelvan a inspeccionar los péptidos personalizados cada 2 años a partir de la fecha de liberación del control de calidad.
Péptidos en solución
Los péptidos en solución son menos estables y propensos a la degradación.. Las soluciones acuosas utilizadas para disolver los péptidos deben ser estériles y puras..
en solucion, una cierta cantidad de péptido puede degradarse, dependiendo de los aminoácidos presentes en la secuencia. Algunos ejemplos se enumeran a continuación.:
– Péptidos que contienen metionina, Los residuos de cisteína o triptófano deben tener un tiempo de almacenamiento limitado en solución debido a la oxidación.. Estos péptidos deben disolverse en un disolvente sin oxígeno.. –
La glutamina y la asparagina se pueden desamidar a ácido glutámico y ácido aspártico., respectivamente. –
La cisteína puede sufrir una ciclación oxidativa para formar un enlace disulfuro cisteína-cisteína. (que pueden formarse dentro o entre enlaces disulfuro). –
Los residuos cargados (ácido aspártico, ácido glutámico, lisina, arginina, histidina) son higroscópicos (absorbiendo agua del aire) y tienden a formar una sustancia viscosa, aceite claro. Este cambio físico puede no afectar la naturaleza del péptido.. Se recomienda liofilizar dichos péptidos para eliminar trazas de agua., luego se desgasifica con nitrógeno para garantizar que no haya vapor de agua en el vial, y luego rápidamente tapado.
Para evitar daños por congelación y descongelación repetidas, Recomendamos que los usuarios solo disuelvan la cantidad de péptido requerida para el experimento actual.. El exceso de solución debe almacenarse a ≥ -20 o C hasta que sea necesario.
Evite la humedad.
Dado que la humedad reduce significativamente la estabilidad a largo plazo de los péptidos, Recomendamos equilibrar los péptidos en un desecador a temperatura ambiente antes de abrir los viales.. Al finalizar la dispensación de péptidos, Los péptidos restantes en el tubo deben purgarse suavemente con nitrógeno anhidro., entonces se debe tapar el recipiente, sellado con una película selladora, y almacenado a -20°C.
¿Cómo se disuelven los péptidos??
Las características de solubilidad de diferentes péptidos varían considerablemente.. Residuos como la alanina. (ala), cisteína (cis), isoleucina (Con), leucina (leu), metionina (Cumplió), fenilalanina (phe), y valina (vale) aumentar la hidrofobicidad y solubilidad del péptido en soluciones acuosas, y se recomienda que el cliente siga estas pautas al personalizar los péptidos.
Propiedades de solubilidad
La solubilidad de los péptidos depende en gran medida de la secuencia de aminoácidos.. Péptidos naturalmente hidrofóbicos (A, F, GRAMO, V, l, I, METRO, W., P con mayor propensión) Requieren disolventes orgánicos para la solubilización.. Péptidos ácidos (mayor propensión a D, E en la secuencia peptídica) Requieren tampones acuosos básicos para la solubilización., mientras que los péptidos básicos (mayor propensión a K, h, y r) Requieren tampones acuosos ácidos para la solubilización..
Selección de solventes
Dadas las limitaciones de su ensayo, Recomendamos utilizar las siguientes pautas para determinar el mejor solvente para solubilizar péptidos.
Péptidos hidrofóbicos
Para resolubilizar péptidos hidrofóbicos., agregar 100 µL de DMSO y sonicar hasta que se forme una solución homogénea. Próximo, agregue el búfer de su elección para hacer un 1 solución mg/mL (cuanto mayor sea la concentración de péptidos, mayor será la cantidad de DMSO requerida).
hidrófilo (Ácido) Péptidos
Para resolubilizar péptidos ácidos., agregar 100 µL de 1% NUEVA HAMPSHIRE 4 OH a 1 mg de péptido y vórtice. Una vez que la solución sea clara, agregue el búfer de su elección para hacer un 1 solución mg/mL.
hidrófilo (Básico) Péptidos
Para reconstituir un péptido básico., agregar agua destilada a 1 mg de péptido y vórtice.
¿Cuál es la diferencia entre el peso neto y bruto del péptido??
El estándar de la industria es entregar péptidos en forma liofilizada como peso bruto.. Peso bruto del péptido es el peso total de todos los componentes presentes en el polvo liofilizado. Esto incluye el péptido de interés., cualquier impureza peptídica, agua, disolventes residuales, y contraion.
De lo contrario Neto peso del péptido, calculado a partir del Contenido neto de péptidos, es el peso de solo el péptido componente presente en el polvo liofilizado. Esto ofrece concentraciones más precisas de sus soluciones peptídicas posteriores.. Por eso, Recomendamos cantidades de peso neto de péptidos para Péptido personalizado pedidos.
Contenido neto de péptidos la medición se realiza mediante análisis de aminoácidos (aaa; Precisión limitada pero requiere una cantidad baja de material.) o análisis elemental (CHN; Requiere miligramos de péptido pero es más preciso.). Ambos métodos arrojan un valor porcentual. (es decir., 75% contenido neto de péptidos).
El contenido neto de péptido depende de la cantidad de contraión presente*, que depende de la secuencia peptídica. Esencialmente, cuanto mayor sea la carga peptídica, cuanto menor sea el contenido de péptidos
*Nota: El elemento utilizado para calcular el contenido neto de péptidos se basa en el contraión peptídico.. Esto se hace para garantizar que el contraión no contribuya a la cantidad del contenido del péptido.. Por ejemplo, cuando el TFA o el acetato son el contraión, Se utiliza nitrógeno porque se encuentra en el péptido pero no en TFA o acetato.. Se puede usar carbono o nitrógeno cuando el cloruro es el contraión por la misma razón..
Cálculos del peso neto del péptido:
Cantidad neta de péptidos (péptido total) — método que utilizamos para pedidos netos de péptidos personalizados.
Multiplique el porcentaje de contenido neto de péptidos (forma decimal) por el peso bruto del péptido, para obtener la cantidad de Cantidad Neta de Péptidos (péptido total).
Por ejemplo:
Para 5 mg de péptido bruto/vial:
El contenido neto de péptidos es 84%.
Cantidad exacta de péptido total = 0.84*5 mg=4,2 mg de péptido total
Cantidad neta de péptido de interés: la más precisa — el cliente puede utilizar este método por su cuenta para calcular el péptido de interés.
Multiplique el porcentaje de contenido neto de péptidos por el peso bruto de péptidos, y la pureza del péptido (por HPLC), para calcular la cantidad exacta del péptido de interés que tienes. El porcentaje neto de péptidos (forma decimal) se multiplica por la pureza del péptido (forma decimal).
Por ejemplo:
Para 5 mg de péptido bruto/vial con:
El contenido neto de péptidos es 84%.
La cantidad exacta de péptido de interés es = 0.84*0.96*5 mg=4,03 mg
MOL Changes utiliza química Fmoc en fase sólida en lugar de química BOC. La química Fmoc permite la eliminación de grupos protectores utilizando condiciones suaves durante el alargamiento del péptido., mientras que la química BOC requiere el uso de un ácido fuerte para eliminar los grupos protectores durante el alargamiento del péptido.. Además, La química Fmoc utiliza ácido trifluoroacético. (TFA) para eliminar el péptido de la resina, mientras que la química BOC utiliza ácido fluorhídrico (frecuencia cardíaca). HF es incoloro, altamente corrosivo, y un veneno de contacto.
Por lo tanto, MOL Changes emplea la química Fmoc ya que es más suave, flexible, y versátil en comparación con la química BOC.
¿Cómo calculo la molaridad de mi péptido??
La molaridad se refiere a la concentración molar de una solución., cual es el número de moles de soluto disueltos en 1 litro de solución, expresado como mol/L, o M.
Molaridad [METRO] = masa / (Volumen x Masa molar); Mol = Concentración (gramos/litro) x Volumen (l)/megavatio (g/mol)
Ejemplo:
Dado: 1mg de péptido seco en polvo con MW: 20kda (La masa molar del péptido es 20 g/mol)
Para determinar la molaridad con masa y volumen conocidos.
Para una solución de 1 ml de este péptido:
Molaridad = Masa (0.001gramo) / (volumen (0.001l) x Masa molar (megavatio 20,000) = 50 µM
Determinar la masa para alcanzar una determinada molaridad.:
Si para tu ensayo, necesita una solución de péptido de trabajo de 0,01 mM en 1 ml de agua, luego calcule la masa requerida de la siguiente manera:
Masa = Molaridad x Volumen x Masa molar
Masa = 0,01 mm x (1/1000 l) x 20.000g/mol = 0,0002g
Por eso, Necesitará 0,2 mg/ml de péptido para tener una solución de trabajo de 0,01 mM..
¿En qué forma se entregan los péptidos??
Entregamos como solución de péptidos y polvo liofilizado o crudo..
¿Cómo sé si mi péptido será soluble??
La solubilidad de un péptido en un disolvente determinado depende de la secuencia de aminoácidos y, a menudo, es difícil de predecir.. En el caso de los péptidos de catálogo, La información de solubilidad aparece en la hoja de datos de control de calidad.. Para péptidos personalizados, por favor consulte la sección titulada “¿Cómo debo solubilizar mi péptido?”.
¿Cuál es la diferencia entre el contenido de péptidos y la pureza de los péptidos??
El contenido de péptidos no es una indicación de la pureza del péptido, ya que se trata de dos mediciones separadas.. La pureza se determina mediante HPLC analítica e indica la presencia/ausencia de otros contaminantes peptídicos. (es decir. péptidos truncados).
El contenido neto de péptido determina la cantidad real del péptido. (péptido de interés así como los péptidos contaminantes) presente en la muestra. El contenido neto de péptidos se mide tradicionalmente mediante análisis de aminoácidos. (aaa; Precisión limitada pero requiere una pequeña cantidad de material.) o análisis elemental (CHN; Requiere miligramos de péptido pero es más preciso.).
¿Cómo purificas generalmente tus péptidos??
Los péptidos MOL Changes generalmente se purifican mediante HPLC preparativa de fase inversa., usando 2 buffers que contienen 0.1% ácido trifluoroacético (TFA). El primer buffer (Tampón A) está compuesto de 0.1 % TFA en agua desionizada y el segundo tampón (Búfer B) está compuesto de 0.1 % TFA en acetonitrilo (ACN).
Generalmente, Los péptidos crudos se disuelven primero en una solución de Tampón A, cierta cantidad de tampón B, o un disolvente polar orgánico como DMSO. Si se utilizó un disolvente polar orgánico o tampón B, Esta solución transparente se diluirá primero con el tampón A.. Próximo, la solución peptídica se filtra y se carga en el sistema de HPLC preparativa. Utilizando un gradiente de método optimizado, Luego se recogen las fracciones basándose en las lecturas de absorbancia.. Luego, cada fracción se analiza mediante una HPLC analítica para garantizar que la pureza de cada fracción cumpla con la especificación de pureza requerida..
Estas fracciones "puras" luego se combinan y se liofilizan.. Luego se prueba la pureza y la identidad del polvo "puro" para garantizar que se haya fabricado el péptido correcto..
Finalmente, Un grupo de control de calidad independiente en AnaSpec prueba nuevamente el péptido para garantizar que todos los atributos de prueba cumplan con las especificaciones requeridas..
¿Cómo escribo los términos de mi secuencia peptídica??
La nomenclatura internacional utilizada para los términos de secuencia es la siguiente:
– extremo N: H significa amina libre (NH2-), Ac significa acetilo [CH3C(oh)-NUEVA HAMPSHIRE-], Pyr significa ácido piroglutámico
– terminal C: OH significa ácido libre (-COOH), NH2 significa amida [-CONH2]
– Las modificaciones en la cadena lateral de los aminoácidos se representan entre paréntesis después del aminoácido correspondiente.. Por ejemplo; serina fosforilada = S(PO3H2) o lisina épsilon-N-acetilada = K(C.A)
¿Qué es un contraión peptídico??
Durante la producción de péptidos, Los iones en las soluciones de síntesis y purificación se unen a las cadenas laterales de aminoácidos cargadas del péptido., formando sales. Estos iones se conocen como contraiones peptídicos y ayudan a equilibrar la carga del péptido..
Ácido trifluoroacético (TFA) Se utiliza comúnmente en la síntesis y purificación de péptidos..
Forma sales de trifluoroacetato con aminoácidos básicos. (p.ej., lisina, arginina, histidina) y la amina N-terminal libre. Por lo tanto, El trifluoroacetato suele ser el contraión predeterminado..
El número mínimo de moléculas de TFA unidas a un péptido es proporcional al número de residuos básicos en una secuencia peptídica determinada.. De este modo, Los residuos más básicos presentes en un péptido., cuanto menor sea el contenido neto de péptidos del polvo liofilizado. Para tener en cuenta el contenido de TFA o agua presente en la muestra., Recomendamos realizar un ensayo de contenido de péptidos para cada péptido personalizado..
Agua y ácido trifluoroacético. (TFA) Son subproductos del proceso de purificación.. Sin embargo, Los TFA pueden generar preocupaciones sobre la toxicidad para vivo y estudios preclínicos. Por lo tanto, MOL Changes ofrece acetato no tóxico, cloruro, o intercambiadores de sales de amonio.
¿Por qué son los péptidos que contienen Cys?, Cumplió, o Trp difícil de sintetizar?
Péptidos que contienen Cys, Cumplió, o Trp son difíciles de sintetizar y obtener productos de alta pureza. Esto se debe principalmente a la inestabilidad y susceptibilidad a la oxidación de estos grupos funcionales.. Se requiere especial atención para el uso y almacenamiento de estos péptidos para evitar la apertura repetida de los viales..
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