Ofte stillede spørgsmål
Simpelthen til kompleks fra milligram til kilogram
Custom Quote Request
How to store peptides?
Lyofiliserede peptider
Til langtidsopbevaring af peptider, vi anbefaler at opbevare dem som et fast pulver. Lyofiliserede peptider kan opbevares ved -20°C eller lavere med minimal nedbrydning. Kunder rådes til at geninspicere tilpassede peptider hver gang 2 år fra datoen for kvalitetskontroludgivelsen.
Peptider i opløsning
Peptider i opløsning er mindre stabile og tilbøjelige til nedbrydning. Vandige opløsninger, der bruges til at opløse peptider, skal være sterile og rene.
I opløsning, en vis mængde peptid kan blive nedbrudt, afhængigt af aminosyrerne i sekvensen. Nogle eksempler er anført nedenfor:
– Peptider indeholdende methionin, cystein- eller tryptofanrester bør have begrænset opbevaringstid i opløsning på grund af oxidation. Disse peptider bør opløses i et iltfrit opløsningsmiddel. –
Glutamin og asparagin kan deamideres til glutaminsyre og asparaginsyre, henholdsvis. –
Cystein kan gennemgå oxidativ ringslutning for at danne en cystein-cystein disulfidbinding (som kan dannes i eller mellem disulfidbindinger). –
De ladede rester (asparaginsyre, glutaminsyre, lysin, arginin, histidin) er hygroskopiske (absorberer vand fra luften) og har tendens til at danne en viskøs, klar olie. Denne fysiske ændring påvirker muligvis ikke peptidets natur. Det anbefales, at sådanne peptider lyofiliseres for at fjerne spormængder af vand, derefter afgasset med nitrogen for at sikre, at der ikke er vanddamp i hætteglasset, og derefter hurtigt et loft.
For at forhindre skader ved gentagen frysning og optøning, vi anbefaler, at brugere kun opløser den mængde peptid, der kræves til det aktuelle eksperiment. Overskydende opløsning skal opbevares ved ≥ -20 o C indtil nødvendigt.
Undgå fugt.
Da fugt reducerer peptidernes langsigtede stabilitet betydeligt, vi anbefaler at ækvilibrere peptiderne i en ekssikkator til stuetemperatur, før hætteglassene åbnes. Efter afslutning af peptiddispensering, de resterende peptider i røret skal renses forsigtigt med vandfrit nitrogen, så skal beholderen have låg, forseglet med en forseglingsfilm, og opbevaret ved -20°C.
Opløselighedsegenskaberne for forskellige peptider varierer betydeligt. Rester såsom alanin (Ala), cystein (Cys), isoleucin (Med), leucin (Leu), methionin (Opfyldt), phenylalanin (Phe), og valin (Val) tilføje til peptidets hydrofobicitet og opløselighed i vandige opløsninger, og det anbefales, at kunden følger disse retningslinjer ved tilpasning af peptider.
Opløselighedsegenskaber
Opløseligheden af peptider er meget afhængig af aminosyresekvensen. Naturligt hydrofobe peptider (EN, F, G, V, L, jeg, M, W, P med højere tilbøjelighed) kræver organiske opløsningsmidler til solubilisering. Sure peptider (højere tilbøjelighed til D, E i peptidsekvensen) kræver basiske vandige buffere til solubilisering, mens grundlæggende peptider (højere tilbøjelighed til K, H, og R) kræver sure vandige buffere til solubilisering.
Valg af opløsningsmiddel
I betragtning af begrænsningerne i din analyse, vi anbefaler at bruge følgende retningslinjer til at bestemme det bedste opløsningsmiddel til solubilisering af peptider
Hydrofobe peptider
At resolubilisere hydrofobe peptider, tilføje 100 µL DMSO og soniker indtil en homogen opløsning er dannet. Næste, tilføje bufferen efter eget valg for at lave en 1 mg/ml opløsning (jo højere peptidkoncentration, jo større mængde DMSO, der kræves).
Hydrofil (Syrlig) Peptider
At resolubilisere sure peptider, tilføje 100 µL af 1% NH 4 Åh til 1 mg peptid og vortex. Når opløsningen er klar, tilføje bufferen efter eget valg for at lave en 1 mg/ml opløsning.
Hydrofil (Grundlæggende) Peptider
At rekonstituere et basispeptid, tilsæt destilleret vand 1 mg peptid og vortex.
Hvad er forskellen mellem netto vs brutto peptidvægt?
Industristandarden er at levere peptider i lyofiliseret form som en bruttovægt. Brutto peptidvægt er den samlede vægt af alle komponenter til stede i det frysetørrede pulver. Dette inkluderer peptidet af interesse, eventuelle peptid-urenheder, vand, resterende opløsningsmidler, og modion.
Tværtimod Net peptidvægt, beregnet ud fra Netto peptidindhold, er vægten af kun peptidet komponent til stede i det frysetørrede pulver. Dette giver mere nøjagtige koncentrationer af dine efterfølgende peptidopløsninger. Derfor, vi anbefalede netto peptidvægtmængder for Brugerdefineret peptid ordrer.
Netto peptidindhold måling udføres ved aminosyreanalyse (AAA; begrænset nøjagtighed, men kræver en lav materialemængde) eller elementær analyse (CHN; kræver milligram peptid, men er mere præcis). Begge metoder giver en procentuel værdi (dvs., 75% netto peptidindhold).
Nettopeptidindholdet afhænger af mængden af tilstedeværende modion*, som er afhængig af peptidsekvensen. I det væsentlige, jo højere peptidladning, jo lavere peptidindhold
*Note: Det element, der bruges til at beregne nettopeptidindholdet, er baseret på peptidmodionen. Dette gøres for at sikre, at modionen ikke bidrager til mængden af peptidindhold. F.eks, når TFA eller acetat er modionen, nitrogen bruges, fordi det findes i peptidet, men ikke i TFA eller acetat. Kulstof eller nitrogen kan bruges, når chlorid er modion af samme grund.
Netto peptidvægtberegninger:
Netto peptidmængde (totalt peptid) — metode, vi bruger til nettilpassede peptidordrer.
Multiplicer nettopeptidindholdsprocenten (decimalform) efter peptidets bruttovægt, for at opnå mængden af netto peptidmængde (totalt peptid).
F.eks:
For 5 mg brutto peptid/hætteglas:
Peptid nettoindhold er 84%.
Præcis mængde af totalt peptid = 0.84*5 mg=4,2 mg totalt peptid
Netto peptid af interesse - den mest nøjagtige — Kunden kan bruge denne metode på egen hånd til at beregne peptid af interesse.
Multiplicer netto peptidindhold i procent med peptidets bruttovægt, og peptidrenheden (ved HPLC), for at beregne den nøjagtige mængde af det peptid af interesse, du har. Netto peptidprocent (decimalform) multipliceres med peptidrenhed (decimalform).
F.eks:
For 5 mg brutto peptid/hætteglas med:
Peptid nettoindhold er 84%.
Den nøjagtige mængde af peptid af interesse er = 0.84*0.96*5 mg=4,03 mg
MOL Changes bruger fastfase Fmoc-kemi frem for BOC-kemi. Fmoc-kemi muliggør fjernelse af beskyttelsesgrupper under milde forhold under peptidforlængelse, mens BOC-kemi kræver brug af en stærk syre til at fjerne beskyttelsesgrupperne under peptidforlængelse. Derudover, Fmoc-kemi anvender trifluoreddikesyre (TFA) at fjerne peptidet fra harpiksen, mens BOC kemi bruger flussyre (HF). HF er farveløs, stærkt ætsende, og en kontaktgift.
Derfor, MOL Changes anvender Fmoc-kemi, da den er mere mild, fleksibel, og alsidig sammenlignet med BOC kemi.
Hvordan beregner jeg molariteten af mit peptid?
Molaritet refererer til den molære koncentration af en opløsning, som er antallet af mol opløst stof opløst i 1 liter opløsning, udtrykt som mol/L, eller M.
Molaritet [M] = Messe / (Volume x Molar Mass); Muldvarp = Koncentration (g/L) x Volumen (L)/MW (g/mol)
Eksempel:
Givet: 1mg tørt peptidpulver med MW: 20KDa (Molær masse af peptid er 20 g/mol)
At bestemme molaritet med kendt masse og kendt volumen
For en 1 ml opløsning af dette peptid:
Molaritet = masse (0.001g) / (bind (0.001L) x Molar masse (MW 20,000) = 50 µM
At bestemme masse for at opnå en vis molaritet:
Hvis til din analyse, du skal bruge 0,01 mM arbejdspeptidopløsning i 1 ml vand, derefter beregne den nødvendige masse som følger:
Masse = Molaritet x Volumen x Molar Masse
Masse = 0,01 mM x (1/1000 L) x 20.000 g/mol = 0,0002 g
Derfor, du skal bruge 0,2 mg/ml peptid for at have en fungerende opløsning på 0,01 mM.
I hvilken form afgives peptider?
Vi leverer som lyofiliseret eller rå pulver og peptidopløsning.
Hvordan ved jeg, om mit peptid vil være opløseligt?
Opløseligheden af et peptid i et givet opløsningsmiddel er afhængig af aminosyresekvensen og ofte svær at forudsige. I tilfælde af katalogpeptider, opløselighedsoplysningerne er angivet på QC-databladet. Til brugerdefinerede peptider, se venligst afsnittet med titlen “Hvordan skal jeg opløse mit peptid”.
Hvad er forskellen mellem peptidindhold og peptidrenhed?
Peptidindhold er ikke en indikation af peptidets renhed, da disse er to separate målinger. Renhed bestemmes ved analytisk HPLC og indikerer tilstedeværelse/fravær af andre peptidiske kontaminanter (dvs. trunkerede peptider).
Netto peptidindhold bestemmer den faktiske mængde af peptidet (peptid af interesse såvel som peptidkontaminanter) til stede i prøven. Nettoindholdet af peptider måles traditionelt ved aminosyreanalyse (AAA; begrænset nøjagtighed, men kræver en lav mængde materiale) eller elementær analyse (CHN; kræver milligram peptid, men er mere præcis).
Hvordan renser du generelt dine peptider?
MOL Changes peptider oprenses generelt ved omvendt fase præparativ HPLC, bruger 2 buffere indeholdende 0.1% trifluoreddikesyre (TFA). Den første buffer (Buffer A) er sammensat af 0.1 % TFA i deioniseret vand og den anden buffer (Buffer B) er sammensat af 0.1 % TFA i acetonitril (ACN).
Generelt, rå peptider opløses først i en opløsning af enten buffer A, en vis mængde buffer B, eller et organisk polært opløsningsmiddel, såsom DMSO. Hvis der blev brugt et organisk polært opløsningsmiddel eller buffer B, denne klare opløsning vil først blive fortyndet med buffer A. Næste, peptidopløsningen filtreres og fyldes på det præparative HPLC-system. Brug af en optimeret metodegradient, fraktioner opsamles derefter baseret på absorbansaflæsningerne. Hver fraktion analyseres derefter via en analytisk HPLC for at sikre, at renheden af hver fraktion opfylder den krævede renhedsspecifikation.
Disse "rene" fraktioner samles derefter og lyofiliseres. Det "rene" pulver testes derefter for både renhed og identitet for at sikre, at det korrekte peptid er blevet fremstillet.
Endelig, en uafhængig QC-gruppe hos AnaSpec tester igen peptidet for at sikre, at alle testattributterne opfylder de påkrævede specifikationer.
Hvordan skriver jeg mine peptidsekvenstermini?
Den internationale nomenklatur, der anvendes til sekvenstermini, er som følger:
– N-terminal: H betyder fri amin (NH2-), Ac betyder acetyl [CH3C(O)-NH-], Pyr betyder pyroglutaminsyre
– C-terminal: OH betyder fri syre (-COOH), NH2 betyder amid [-CONH2]
– Ændringer på sidekæden af aminosyrer er afbildet i parentes efter den tilsvarende aminosyre. F.eks; phosphoryleret serin = S(PO3H2) eller epsilon-N-acetyleret lysin = K(Ac)
Under peptidproduktion, ioner i syntese- og rensningsopløsningerne binder til de ladede aminosyresidekæder af peptidet, danner salte. Disse ioner er kendt som peptidmodioner og hjælper med at balancere peptidets ladning.
Trifluoreddikesyre (TFA) er almindeligt anvendt i peptidsyntese og oprensning.
Det danner trifluoracetatsalte med basiske aminosyrer (f.eks., lysin, arginin, histidin) og den frie N-terminale amin. Derfor, trifluoracetat er typisk standardmodionen.
Minimumsantallet af TFA-molekyler bundet til et peptid er proportionalt med antallet af basiske rester i en given peptidsekvens. Således, de mere basiske rester til stede i et peptid, jo lavere er nettopeptidindholdet i det frysetørrede pulver. For at tage højde for TFA eller vandindholdet i prøven, vi anbefaler at udføre en peptidindholdsanalyse for hvert tilpasset peptid.
Vand og trifluoreddikesyre (TFA) er biprodukter fra rensningsprocessen. Imidlertid, TFA kan give anledning til toksicitetsbekymringer for i live og prækliniske undersøgelser. Derfor, MOL Changes tilbyder ikke-giftigt acetat, chlorid, eller ammoniumsaltbyttere.
hy er peptider indeholdende Cys, Opfyldt, eller Trp svært at syntetisere?
Peptider indeholdende Cys, Opfyldt, eller Trp er udfordrende at syntetisere og opnå produkter med høj renhed. Dette skyldes hovedsageligt ustabiliteten og modtageligheden for oxidation af disse funktionelle grupper. Særlig opmærksomhed er påkrævet ved brug og opbevaring af disse peptider for at undgå gentagen åbning af hætteglassene.
Gik vi glip af dit spørgsmål? Send os en linje og det vil vi
komme indenfor igen 24 timer.
