Брз одговор
An eight-residue peptide — Ac-VCTLCSCY — was synthesized from the conserved metal-binding motif of cobalt nitrile hydratase, loaded with one equivalent of Co(I…
Ензимскиот проблем Пептидот е дизајниран да го заобиколи
Ацетил хексапептид 1 Трговија на големо Извори на пептиди Активната локација на нитрил хидратаза од типот на Co содржи Co(III) во една N2S3 прва координативна сфера: два амидатни азоти од 'рбетот и три сулфури добиени од цистеин во три различни состојби на оксидација - тиолат, сулфенат и сулфинат. На 1.8 Å кристална структура на Псевдонокардија термофила ензим (PDB 1IRE) го решава αCys111 како цистеин-сулфинска киселина и αCys113 како цистеин-сулфенска киселина, истиот модел што се гледа во железниот ензим.
Доаѓањето таму не е спонтан чекор на преклопување. Созревањето бара активатор протеин, и за PtNHase Zhou и соработниците предложија механизам за замена на α-подединица: прво се формира апо-α2β2 тетрамер, единечна α-подединица врзува две Co(II)-кои содржат ε протеини, се вметнува кобалт и се оксидираат металот плус екваторијалните цистеини, а сега функционалните α-подединици се заменети во апо-тетрамер. Студијата на Frontiers јасно кажува дека малку се знае за тоа како се случува ова на атомско ниво.
Тоа е интерпретативниот проблем. Во холоензимот, метално вметнување, оксидација на цистеин, склопувањето на подединицата и учеството на активаторот се случуваат на исто место во периоди на преклопување. Спектроскопска промена во примерокот на ензим кој созрева не може да се припише на една од тие причини, бидејќи другите се уште трчаат. Соголувањето на скелето не ја отстранува релевантноста; ги отстранува конфузите што го прават домашниот систем нечитлив една по една променлива.
Што всушност го одредува „Моделирано на мотивот“.
Конзервираниот мотив е CXXCSCX, а студијата го опишува како сеприсутен меѓу NHases. Конструкцијата произлезена од PtМотивот на NHase е Ac-VCTLCSCY: осум остатоци, молекуларна маса 933.13 И, со додадена ацетил група на N-крајот за да се подобри растворливоста. Пептидот беше испорачан како лиофилизиран прав од >98.5% чистота и се користи како што е предвидено.
Секој позиционен елемент функционира. Растојанието на цистеин се поставува таму каде што седат тиолатите во однос еден на друг и на металот. Ser6 се наоѓа помеѓу координирачките цистеини, и во пресметковните модели неговите странични верижни водородни врски за врзување на цистеински сулфури преку две експлицитни води од надворешната сфера. Ц-терминалниот тирозин е присутен во експерименталниот пептид, но беше скратен на метил група во моделите DFT, како што беа некоординирачките странични синџири на Вал, Thr и Leu; N-терминалниот ацетил беше моделиран како формил. Скоро сите атоми на 'рбетот плус страничните синџири на Cys2, Cys5, Ser6 и Cys7 беа задржани.
Искрената граница на конструкцијата е флексибилноста. Пептид со осум остатоци во тампон не поседува една координативна геометрија; тоа примероци неколку, што е токму причината зошто спектарот EPR покажува две состојби на вртење наместо една. Моделите се исто така скратени и растворени со поларизирачки континуум (e = 80.4) плус две експлицитни води - разумен третман, но не и целосниот пептид.
Последицата од спецификацијата е директна. Испуштена е ацетил капа, заменет остаток, или измешана шема на цистеин го менува множеството на лиганди. Ниту една низводна спектроскопија не го враќа планираниот експеримент од пептид со погрешен сет на лиганди; едноставно ќе известува за различна молекула со иста приближна маса.
Зошто краток пептид е контролиран модел, Не е поедноставен ензим
Прашањето што го поставија авторите беше тесно: дали самата конзервирана секвенца за врзување на метал NHase содржи доволно хемиски информации за врзување на Co(II) и да претрпи промени на металниот центар и пептидот по изложување на диоксиген? Тоа е прашање за низа, а низа е она што синтетичкиот пептид го испорачува без остатокот од протеинот.
Истата платформа веќе е користена кај металите. Идентичниот пептид врзува Fe со високо вртење(II) центар анаеробно, и изложеноста на O2 прво генерира средно-спин (S = 3/2) Fe(III) центар кој се претвора во Fe со низок спин(III) како што оксидираат екваторијалните цистеини. Конструкција што може да се натовари со железо, а потоа со кобалт, и се чита со истите спектроскопи, е тест кревет за повеќекратна употреба наместо еднократна молекула.
Најблиската надворешна споредба е SODA пептидот (ACDLPCG), секвенца од седум остатоци од никел супероксид дисмутаза. Во Броеринг и студија на соработници, Co-SODA оксидира во два растворливи чекори: за неколку секунди металот остана парамагнетен (Co²⁺) додека сулфурот К-раб XAS покажа еден тиолат претворен во сулфинат; со часови, магнетната подложност и Co K-раб XAS покажаа дека металот оди до Co³⁺. Вториот тиолат не оксидираше понатаму и не се формираше каталитички активен комплекс - што се припишува на отсуството на аксијалниот тиолат. Тоа е различен пептид со различна низа на оксидација, и не треба да се спојува со резултатите Ac-VCTLCSCY; неговата вредност овде е како преседан за она што металопептидот може и не може да го реши.
Литературата за преглед ја дава противтежата. Преглед на Шалев за метал-пептид NMR забележува дека пептидите се доволно флексибилни за да одговараат на неточни геометрии за време на пресметката на структурата, произведувајќи погрешни структурни резултати, и дека моделите добиени од пептид може да се врзат со помал афинитет бидејќи не се зачувани сите сврзувачки делови. Тоа не е аргумент против пристапот; тоа е причината поради која пресметковните модели и повеќекратните спектроскопи треба да се читаат заедно. Модел кој е погрешен во дефинирана, инспекцискиот начин ви кажува повеќе од холоензим кој е точен од причини што никој не може да ги изолира.
Што всушност направи Кобалтот: Држави за координација и спин
Под анаеробни услови, УВ-видливиот спектар на Ко(II)-пептидниот комплекс покажа интензивни ленти за пренос на полнеж од лиганд на метал кај 305 nm (e = 2800 M-1cm-1) и 355 nm (e = 2180 M-1cm-1), доделен на цистеин тиолат-to-Co(II) пренос на наплата. Бидејќи споредливите металопептидни студии го ставаат секој тиолат-Co(II) интеракција на приближно 900-1200 M-1cm-1, набљудуваните интензитети се конзистентни со два врзани тиолати, оставајќи го третиот цистеин слаб или некоординиран. Послаби ленти на полиња на лиганди на приближно 615, 685 и 735 nm (ε≈ 300-400 M-1cm-1) се со повисок интензитет од octahedral Co(II) типично дава, покажувајќи на координативен број од четири или пет.
Титрирање на апо-пептидот со Co(II) додека се следи апсорпцијата на ~ 685 nm одговара приближно на едно место за врзување по пептид, со привидна Кг,апликација на 0.45 µM. Авторите се експлицитни за тоа што може да поднесе таа бројка: бидејќи концентрацијата на пептид во голема мера ја надминува поставената вредност, титрацијата се воспоставува тесно, приближно стехиометриско врзување, но не одредува ригорозно константа на субмикромоларна дисоцијација. Вредноста е споредлива со оние пријавени за пептидните комплекси Co-NiSOD и Co-SODA.
Икс-бенд EPR на 12 К реши два сигнала. Првата е малку ромбична ниска спин Co(II) карактеристика со е-вредности на 2.30, 2.25 и 2.03; L-бенд EPR на 1.3 GHz го урна е-доволно напрегајте за да се реши Јас = 7/2 хиперфина структура многу појасно. Вториот е сигнал со ниска амплитуда со висок спин помеѓу 1,000 и 2,000 G со решени пресвртни точки на г" = 5.7 и 4.8, во согласност со ан С = 3/2 систем. Интеграцијата даде приближно еднаков релативен интензитет за двајцата под анаеробни услови.
DFT фаворизираше искривена тетраедрална N2S2 геометрија за видовите со високо вртење и петкоординати, искривена квадратно-пирамидална геометрија за видовите со низок спин, со шест модели генерирани низ трите можни позиции на неутралниот CysSH (Cys2, Cys5 или Cys7). Пресметано е-вредности за моделите со пет координати (1.98–2,57) паѓаат во разумна согласност со експерименталниот опсег 2,03-2,40, а моделот со неутрален тиол во Cys7 го репродуцираше аксијалниот карактер на експерименталната е-тензорот особено добро. Толкувањето на авторите - повеќекратни геометрии на координација достапни во флексибилно скеле - е интерпретација поддржана од пресметување и спектроскопија заедно, не е измерена структура.
Оксидација: Што се смени, Што се заклучи, и што не беше решено
Изложеноста на диоксиген го изгасна Ко(II) EPR сигнализира брзо, без кислород-зависна промена во пропорциите на високи- и видови со низок спин што може да се проценат пред да исчезнат сигналите. Споредба со Ко(II) во тампон воспоставени две работи: сигналот со висок спин од воден кобалт беше различен од сигналот во комплексот, а изложеноста на воздухот не го ослободи само кобалтот од пептидот. Губењето на сигналот е во согласност со оксидацијата до EPR-тивко ниско-вртење Co(III), и UV-видливиот спектар се промени соодветно - d-d преминува помеѓу 600 и 750 nm се намали и исчезна додека нови бендови се појавија приближно 350, 465 и 620 nm, карактеристика на тиолат-до-Ко(III) пренос на наплата.
На страната на пептидот, q-TOF LC-MS покажа сигнали конзистентни со инкорпорирање до три атоми на кислород по изложување на воздух. Оксигенираните видови се зголемија во релативен интензитет кај 10 и 15 ч, и повисоко-m/z врвовите веројатно одговараат на водни адукти. Смените се во согласност со оксидацијата на цистеин до деривати на сулфена и сулфинска киселина, истите модификации пронајдени во родната активна локација.
Две работи што податоците не ги утврдуваат, и весникот вели така. Масовната спектрометрија директно не ја утврдува состојбата на оксидација на металниот центар. И редоследот на оксидација на метал и лиганд не може да се утврди од сегашните податоци - резултатите покажуваат дека двата процеси се случуваат за време на реакцијата со диоксиген, не што оди прво.
Контролите се важни исто колку и резултатот. Растворот само со пептид остана безбоен при изложување на воздух, но на крајот се таложи, најверојатно преку формирање на дисулфид. Помали оксигенирани видови се појавија дури и без кобалт, во согласност со ниско ниво на оксидација на цистеин при ракување со примерокот. Тоа е доказ на студијата дека основната позадина на оксидација се очекува наместо хипотетички.
Авторите исто така укажуваат на претпазливост за иднината: продолжената изложеност на кислород може да генерира поопширно оксидирани видови, потенцијално вклучува средина со биссулфинска киселина аналогна на прекумерно оксидирана, неактивна NHase. За секој што го продолжува времето на инкубација, тоа е предвидување за тестирање, не е решен исход.
Аналитичка потврда: Која техника одговара на кое прашање
Секоја техника во оваа студија одговара на едно прашање и е слепа за тоа Означени пептиди други. Читањето металопептидна хартија значи да се знае која е која.
УВ-видливата апсорпција одговара дали тиолатот е врзан за металот и приближно колку, преку интензитетот на LMCT опсегот наспроти ~900-1200 M-1cm-1 по-тиолат репер. Не може да ја реши состојбата на центрифугата или геометријата, и не може да ви каже кој цистеин е врзан.
MCD и EPR одговараат какви состојби на спин се присутни и во која пропорција; Интегрираните интензитети на EPR го дадоа приближно еднаков сооднос високо/ниско центрифугирање, и резолуцијата на L-појасот го потврди доделувањето на низок спин преку хиперфина структура. Но, EPR е слепа за EPR-silent Co(III), така што исчезнувањето на сигналот е во согласност со оксидацијата без да биде директно мерење на истиот.
LC–MS одговара колку кислород има на пептидот и како тој напредува со текот на времето. Ништо не кажува кој сулфур ги носи, и ништо за оксидационата состојба на металот. Општите граници на масената спектрометрија со оксидативна модификација се добро документирани - Работни текови специфични за модификација имајте предвид дека доделувањето модификација на одреден остаток обично бара интерпретација на MS/MS, и дека квантифицирањето на оксидирани наспроти неоксидирани видови од екстрахирани јонски хроматограми претпоставува споредлива ефикасност на јонизација и пренос.
DFT одговара кои модели на координација се геометриски и енергетски веродостојни, но само за скратените модели кои се всушност пресметани - не за целосниот пептид во раствор.
На страната на синтезата, проверките на сопственото ослободување на студијата се поучни: слободните тиоли во 0.76 mM апо-пептидната состојба беше потврдена со Елмановата анализа, и моларната апсорпција кај 280 nm (1,096 M-1cm-1) беше воспоставена од стандардна крива, така што концентрацијата може да се знае наместо да се претпоставува. Ниту, пак, е техника на карактеризација на металопротеини, и двете се предуслови за едно.
Практичното правило: ниту една техника во оваа листа не е доволна. Извештај за карактеризација кој нуди само еден не карактеризира металопептид.
Чистота, Идентитетот, Содржината и состојбата на оксидација се четири различни прашања
Примерок може да биде 98% чист со HPLC и сè уште е неупотреблив за Co(II) експеримент. Палмитоил пентапептид-4 Очигледниот парадокс се раствора откако четирите прашања ќе се одвојат.
Чистотата е релативна површина процент од HPLC. Таа кажува колку од материјалот што апсорбира УВ елуира како главен врв. Не кажува кој е тој врв, и не разликува цистеин што е редуциран од оној што е веќе оксидиран ако и двата се елуираат заедно.
Идентитетот е ортогонална структурна потврда. Овде тоа значи масена спектрометрија, и сопственото LC-MS на студијата покажува зошто едно мерење на маса има граници: откако кислородните адукти ќе ја префрлат масата за 16 Да по кислород, оксидиран пептид и различен пептид може да се помешаат освен ако резолуцијата на масата и хроматографскиот контекст не се соодветни.
Содржина, или нето пептид, е рамнотежа на масата - пептид плус контрајон, вода и сол. Овде е директно важно бидејќи стехиометријата на врзувачката титрација зависи од тоа колку пептид всушност има во киветот. Номиналната концентрација пресметана од измерениот прав без определување на содржината може да биде доволно исклучена за да се помести поставената крива на врзување.
Состојбата на оксидација е својство на цистеините и металот што ниту HPLC ниту недопрената маса не го известуваат чисто. Лиофилизиран прав што е 98% чиста со HPLC може да содржи значителна фракција на цистеини веќе оксидирани во сулфени или дисулфидни форми од ракување и лиофилизација. Тоа би се претставило како малку поголема маса, променето време на задржување, или едноставно намален титар на слободен тиол од Елман. Набљудувањето на студијата на помали оксигенирани видови во отсуство на кобалт, се припишува на ракување со примероци, е доказ дека оваа позадина е реална.
Следува правилото за одлучување: за металопептидна работа чувствителна на оксидација, наведете ја содржината на слободен тиол и профилот на оксидација како критериуми за ослободување, не само чистота на HPLC и масовна проверка. Аналитичките принципи зад таквите спецификации се истите оние наведени во I Q2(R2), кој го третира идентитетот, чистота и анализа како посебни карактеристики на изведба наместо како заменливи.
Ракување со метал и работен тек чувствителен на кислород
Она што го известува студијата е специфично и вреди точно да се копира. Сите примероци на пептиди беа подготвени под анаеробни услови во кутија за ракавици со мека страна Coy. Пептидот беше растворен во дегазиран 10 mM N-етил морфолин (НЕ) пуфер на pH вредност 8.0, давајќи безбоен 0.76 mM апо-пептид кој беше растворлив и потврден за слободни тиоли со Елмановата анализа. Еден еквивалент на CoCl2·6H2O, растворени во истиот пуфер со иста pH вредност, беше додаден во пуферираниот пептид.
Она што следува од хемијата на координација, а не од трудот, вреди да се наведе како дизајнерско размислување. Редоследот на додавање и соодносот метал-пептид одредуваат дали планираното 1:1 сложени форми или мешавина прави; затоа титрацијата беше извршена наместо да се претпоставуваше. Изборот на тампон е важен бидејќи координирачките бафери се натпреваруваат за металот, а NEM беше избран како некоординирачки морфолински пуфер. А, врнежите само за пептиди при изложеност на воздух значи дека формирањето на дисулфид е конкурентна патека што го отстранува пептидот од растворот пред да може да го врзе кобалтот - канал на загуба што се намалува со времето на ракување. Полипептид на панкреасот
Искрениот јаз: трудот не известува за систематска оптимизација на односот на металот, редослед на додавање или идентитет на тампон. Читателот што го зголемува ова го проширува методот, не го копира, и треба да ја третираат секоја од тие променливи како нешто што треба да се потврди во нивниот сопствен систем, а не како универзално барање.
Каква Р&Оловото треба да праша пред да го пушти во употреба металопептид чувствителен на оксидација
Прашањата подолу се оние кои одлучуваат дали купениот металопептид го поддржува експериментот. Секој е одговорен во разговор за спецификација.
Секвенца и верзија. Дали точната секвенца - вклучувајќи го N-терминалниот ацетил и сите нестандардни остатоци - е снимена како запис контролиран од верзијата, и дали тоа го наведува сертификатот? Уредување на секвенца без трага на непроменлива верзија е најчеста причина за нерепродуктивен металопептиден експеримент.
Статус на цистеин. Која е содржината на слободен тиол при ослободување, со кој метод, и кои видови на оксидација се наведени како граници? Ова е прашањето за кое сопственото набљудување на ракување-оксидација на студијата не може да се преговара. Производител на ацетил хексапептид-1
Идентитетот. Дали има ортогонална потврда надвор од едно мерење на масата, и дали масената спектрометрија ги разрешува кислородните адукции? Метод кој не може да се одвои +16 Да од родителот не може да пријави профил на оксидација.
Содржина. Дали содржината на нето пептид е пријавена одделно од чистотата на HPLC, и дали е наведена формата на контрајон? Стоихиометријата во титрацијата на врзувањето зависи од првото; однесувањето на тампонот и металната конкуренција може да зависат од второто.
Ракување. Дали материјалот се испорачува во форма и пакување што поддржува анаеробна реконституција, и дали тоа го кажува документацијата? Удобен е лиофилизиран прав, но чекорот на реконституција е местото каде што влегува кислородот.
Аналитички пакет. Дали суровините хроматограми и спектри се испорачуваат со идентификатори на методот — колона, градиент, бранова должина, опсег на маса - наместо збирна табела? Збирната табела не може да се преиспита кога резултатот изгледа погрешен.
Скала. Ако моделот дипломира од милиграми на поголеми серии, дали постои наведена основа за очекување да се одржи профилот на оксидација? Секвенците чувствителни на оксидација се токму таму каде што прво се појавуваат промените во процесот.
Добавувач кој не може да одговори на прашањето за статусот на цистеин, ви кажува нешто за способноста за анализа зад сертификатот. Тоа е единствениот најинформативен одговор на листата.
Каде што застанува моделот
Пептидот не е ензимот. Нему му недостасува β-подединица, протеинот активатор, втората координативна сфера и патеката на созревање со замена на подединица. Споредбата на студијата со природниот систем е по аналогија на состојбата на спин и модификација на лигандот, не со каталитичка активност - овде не беше измерена хидратација на нитрил.
Редоследот на оксидација на метал наспроти лиганд останува нерешен во овој систем, како што наведуваат авторите. Врзувачката константа е привидна вредност измерена под услови кои не дозволуваат ригорозно суб-микромоларно определување. Моделите DFT се скратени и континуумски растворени. И забележаната хемија на оксидација е она што се случува со изолиран мотив во тампон - изјава за внатрешната реактивност на мотивот, не е тврдење за секвенцата на интрацелуларното созревање.
Ништо од ова не го ослабува резултатот. Тоа го дефинира она што го поддржува резултатот: дека конзервираната низа сама по себе носи доволно хемиски информации за да го поврзе Ко(II) и да се подложи на поврзана оксидација на метал и цистеин при изложување на диоксиген.
Заклучок
Пептидот со осум остатоци е важен бидејќи го претвора нерешливото прашање за созревање во збир на мерливи променливи - координативен број, состојба на центрифугирање, број на кислород, статус на слободен тиол - секој со техника што известува за него и документирана слепа точка. Наодот дека конзервираниот мотив сам го врзува Ко(II) и се подложува на поврзана оксидација на метал и цистеин при изложување на воздух е изјава за внатрешните хемиски информации на низата.
Тоа е исто толку доверливо како и верноста на низата на примерокот, оксидациона состојба и аналитичка документација. За тимови кои се градат на ваков модел, следниот чекор е разговор за спецификации наместо нарачка за купување: дефинирање на содржината на слободен тиол, граници на оксидација, нето содржина на пептид и пакетот необработени податоци пред да се направи првиот милиграм. MOL Промени обезбедува сопствени пептиди со HPLC и MS документација, опционално определување на содржината на пептид и анализа на контрајон, и анаеробно-компатибилно ракување по барање; тие способности се релевантни за прашањата за спецификација погоре, и читателите треба да го одмерат тој комерцијален интерес кога ги оценуваат упатствата за избор на добавувачи.
MOL Changes е пептидна наука Р&Организација и снабдување со сопствени пептиди и услуги за аналитичко тестирање. Читателите треба да го измерат овој комерцијален интерес кога ги оценуваат упатствата за избор на добавувачи во оваа статија.
Примарен извор: Оригинална студија за металопептид на кобалт.
