Што всушност треба да направи реагенсот за скрининг на деградација
Пред да се оцени КК, помага да се одвојат вклучените класи на реагенси. Стандардните водичи за протеомски и хемиски сонди ги разликуваат флуоресцентните известувачи, сонди базирани на активност, и реагенси за збогатување на афинитетот, секој конвертирачки убиквитин-протеазом систем (UPS-от) активност во мерливо отчитување во клетките, лизати, или реакции без клетки.
-
Флуоресцентни етикети ви дозволуваат да ги визуелизирате или квантифицирате активните ензими, протеазомски подединици, или репортер супстрати со флуоресценција во гел, микроскопија, или известувачи за добивка/загуба на сигналот.
-
Етикети за биотин се алатки за збогатување, фаќање активни деубиквитинази (DUBs) или модифицирани протеини со повлекување на стрептавидин пред имуноблотирање или идентификација со масена спектрометрија.
-
Убиквитин и NEDD8-миметички сонди и флуорогени или FRET супстрати испитуваат ензими и лигази кои мораат да го разликуваат убиквитин од модификатори слични на убиквитин - хемијата која одлучува дали навистина се случил настан за насочена деградација.
-
Подлоги за разградување носат дестабилизирачка или дегронска секвенца, така што загубата предизвикана од соединенија или зависна од протеазомот произведува квантитативна промена на сигналот.
Секоја од овие улоги се заменува со мал структурен детал: кој остаток е означен, каде што се наоѓа модификација, дали врската со изопептид или оксиестер е точна, и дали боевата глава е присутна на десниот крај. Реагенсот чија „95% чистота“ крие доминантен дес-амидиран или делеционен изомер може да го промени врзувањето, стабилност, или привидната стапка на деградација доволна за да се преобликува интерпретацијата на цел екран.
На означените пептиди им е потребна потврда специфична за етикетата
Флуоресцентна или биотинска ознака не е пасивен додаток. Конјугацијата го менува и времето на задржување и јонизацијата во хроматографијата, и воведува предвидлива масовна промена - но само ако наменетиот вид е она што се формирало.
Квалитетот на реагенсот овде значи потврдување на означени видови, не само матичниот пептид. Тоа обично бара:
-
Синтеза на пептиди масовна спектрометриска верификација на додадената ознака преку очекуваното поместување на масата;
-
LC-MS или UPLC проверува за да потврди дека означената молекула елуира и јонизира како што е дефинирано, доминантни видови;
-
посебно известување за идентитетот за етикетата, бидејќи неговото изменето однесување може да ги маскира несаканите производи кои се излачуваат.
За биотин, грижата е верноста на збогатувањето: делумно означена или погрешно биотинилирана количина може да го врзе стрептавидин поинаку и да го намали погрешниот сет на протеини. За флуорофори, режимот на неуспех е различен, но подеднакво нарушува - нечистотија што автофлуоресцира на брановата должина на анализата имитира вистински сигнал и ги надува стапките на удари. Лабораториите за скрининг сè повеќе бараат од продавачите да ја пријават точната означена маса и хроматограм на конечниот конјугат, не само чистотата на низата.
Модификациите специфични за анализата мора да бидат потврдени, Не се претпоставува
Реагенсите за разградување често не се обични пептиди. Тие носат убиквитин-миметички или NEDD8-миметички елементи, електрофилни боеви глави, афинитетни рачки, поврзувачи, и FRET или флуорогени парови. Товарот на докажување е да се потврди дека наменети структурата доминира во многу и дека нема ненамерен изомер, скратување, или несаканиот производ се акумулирал до ниво што ја нарушува анализата.
За страната со мала молекула на деградаторите, аналитичката практика е веќе експлицитна: робустен пакет користи LC-MS или HPLC за органска чистота, NMR или qNMR за структура и рамнотежа на масата, и често хирална или метална анализа за да се фати стереоцентарската епимеризација и контаминентите во трагови од метал што можат да ја угаснат координацијата на цинкот. Пептидните и протеинските реагенси кои ги хранат истите екрани заслужуваат иста дисциплина - верификација на местото на модификација, потврда за поврзаноста и завршницата, и јасност за тоа дали доминантната нечистотија може да се меша со биолошкото отчитување.
Секвенца верност не се преговара
Скрининг библиотеките и сетовите со сонди обично се нарачуваат според дефинирана примарна структура која шифрира дегрон, мотив за препознавање, место за сечење на ензимот, или сигнал зависен од фосфорилација. Верноста на низата значи дека структурата е она што всушност се испраќа - без бришење, нема замена, без погрешна инкорпорација, и точно Н- и C-крајот.
Верноста е местото каде што најчесто се појавуваат кратенките за истражување. Продавачот кој потврдува сам недопрена маса може да пропушти изомер за бришење со иста номинална маса, или фосфо-локалитет инсталиран на погрешен остаток. Довербата на ниво на секвенца бара мапирање на пептиди или фрагментација на MS/MS, анализа на аминокиселини за состав, и — за силно модифицирани конструкции — потврда дека секоја инсталирана група седи на наменетото место. Кога неуспешниот екран за деградирање или збунувачки резултат DUB се трага назад до „секвенцата на подлогата беше погрешна за еден остаток,„Трошокот е неколку недели неповторливи податоци што ниеден софтвер надолу не може да ги поправи.
Ортогоналната аналитичка потврда ја зголемува довербата
Еден аналитички сигнал ретко го решава идентитетот. Упатство на Европската агенција за лекови за развој Синтетички пептиди и производството на синтетички пептиди препорачува најмалку два ортогонални методи за идентификација, и ортогонална големина-, наплата-, и пристапи базирани на хидрофобност за карактеризација на чистотата.
Ортогоналната потврда е повеќе важна за означените и модифицираните реагенси отколку за едноставните линеарни пептиди, бидејќи ниту еден хроматографски метод не го разрешува секое семејство на нечистотии. Хемичар кој проверува комплексен скрининг конструкција обично ќе го спари HPLC со обратна фаза со хемија од втора колона, комбинираат масовна потврда со MS/MS или мапирање на пептиди, и додадете насочени методи како што се хирално одвојување за стереохемиски интегритет или исклучување на големината со повеќеаголно расејување на светлината за состојба на агрегација. Кога реагенсот дава квантитативно отчитување, овој слоевит доказ е она што ви дозволува да верувате дека тврдењата за идентитет и чистота се реални и репродуктивни - ниту еден процент од врвната површина.
Скрининг библиотеки во живо или умре со конзистентност на серија
Библиотеките за скрининг се изградени од многу бунари, многу ампули, и - освен ако не планирате однапред - многу производствени места. Варијабилноста од серија до серија е тивкиот убиец на надолжните екрани, затоа што наносот во мала нечистотија или поместен хроматографски отпечаток од прст го менува однесувањето на анализата дури и кога секоја серија номинално ги поминува своите спецификации за чистота.
Дисциплината на доследност има три компоненти:
-
Следливост на многу — секоја вијала или библиотечна плоча се врзува за точен идентификатор на серијата и сертификат за анализа специфичен за серијата, така што секој резултат може да се следи до материјалот што го создал.
-
Споредба на отпечатоци од прсти — новите делови се споредуваат со претходните лотови и референтните стандарди според времето на задржување, маса, и профилот на нечистотија, не само со број за чистота на пропуст/неуспех.
-
Документирани необработени податоци - објективни докази (хроматограми, масовни спектри) се обезбедува со секоја серија наместо збирен процент, така што лабораториите за скрининг можат сами да ја проценат конзистентноста. Производство на пептиди
Практичното правило за голема библиотека за деградирање или сонда е да се набави од партнер кој сериското отпечатоци од прсти го третира како рутина и може да покаже како дадена група се споредува со онаа што ги потврди вашите претходни хитови.
Одделение за скрининг за деградација на протеини: Како изгледа „доволно добро“ кога изворот
Можете да го преведете сето ова во краток сет на очекувања кога ќе наведете реагенс или ќе оцените добавувач. Во пракса, лабораториите кои водат работни текови за деградација бараат партнери кои ќе разговараат за КК зад даденото прилагодена синтеза на пептиди нарачајте наместо да предадете една фигура со чистота.
Суштинските се: идентитетот потврден со повеќе од недопрена маса; ознаката и секоја модификација потврдена на конечниот конјугат; верност на секвенцата документирана со аминокиселина или анализа на ниво на мапирање каде што е потребно; ортогонални аналитички методи зад тврдењата за чистота и карактеризација; а тестирање на пептиди запис кој вклучува сурови хроматограми и масени спектри по многу; и конзистентноста на серија-отпечатоци од прсти се одржува низ целата библиотека.
Реномирана платформа за синтеза ќе донесе ортогонално одвојување со степен на снимање, Потврда на ниво на MS/MS, границите на ендотоксинот и био-товарот, и документација на ниво на многу на маса - затоа што тоа е разликата помеѓу реагенсот кој произведува чист екран и оној што тивко произведува лажни позитиви низ сто бунари.
Клуч за носење: Во скрининг за деградација на протеини, квалитетот на реагенсот е валидност на анализата. Потврдете ги означените видови преку матичната секвенца, потврдете ја секоја локација за модификација, користат ортогонални аналитички методи, и наметнете вкрстена конзистентност на отпечатоци од прсти - бидејќи читањето тивко ќе го одрази кое било од овие што е прескокнато.
Следни чекори
Започнете со запишување на класите на реагенси од кои всушност зависи вашиот екран - репортер, сонда, или супстрат - и аналитичката документација што му е потребна на секој. Користете го тоа како основна линија кога изворувате, и побарајте од добавувачите да ве водат низ ортогоналните методи и многу докази за отпечатоци од прсти зад материјалот што ќе го извршите. Неколку минути потрошени за прегледување на КК однапред може да ве спасат од неповторлив резултат од скрининг за кој се потребни недели за да се опуштите.
