Proteoom-afgeleide peptidebibliotheken voor diepgaande specificiteitsprofilering van N-terminale modificatiereagentia

Eiwit- en peptide-N-termini zijn belangrijke doelwitten voor selectieve modificatie met chemoproteomics-reagentia en bioconjugatiehulpmiddelen. Het N-terminale a-amine komt slechts één keer voor in elke polypeptideketen, waardoor het een aantrekkelijk doelwit is voor eiwitbioconjugatie. In cellen, nieuwe N-uiteinden kunnen worden gegenereerd door proteolytische splitsing en worden opgevangen door N-terminale modificatiereagentia die proteoombrede identificatie van proteasesubstraten mogelijk maken met tandemmassaspectrometrie (LC-MS/MS). Een goed begrip van de N-terminale sequentiespecificiteit van de modificatiereagentia is van cruciaal belang voor elk van deze toepassingen. Proteoom-afgeleide peptidebibliotheken in combinatie met LC-MS/MS zijn krachtige hulpmiddelen voor het profileren van de sequentiespecificiteit van N-terminale modificatiereagentia. Deze bibliotheken zijn zeer divers, en LC-MS/MS maakt analyse mogelijk van de modificatie-efficiëntie van tienduizenden sequenties in één experiment. Proteoom-afgeleide peptidebibliotheken zijn een krachtig hulpmiddel voor het profileren van de sequentiespecificiteiten van enzymatische en chemische peptide-labelingreagentia. Subtiligase en 2-pyridinecarboxaldehyde (2PCA) zijn twee reagentia die zijn ontwikkeld voor selectieve N-terminale peptidemodificatie en kunnen worden bestudeerd met behulp van van proteoom afgeleide peptidebibliotheken. Dit protocol schetst de stappen voor het genereren van N-terminaal diverse proteoom-afgeleide peptidebibliotheken en voor het toepassen van deze bibliotheken om de specificiteit van N-terminale modificatiereagentia te profileren. We beschrijven de stappen voor het profileren van de specificiteit van 2-pyridinecarboxaldehyde, een chemisch modificatiereagens, en subtiligase, een enzymatisch modificatiereagens. Deze protocollen kunnen eenvoudig worden aangepast aan alternatieve proteoombronnen en andere N-terminale peptide-labelingreagentia.