Ustrezna metoda raztapljanja je pomemben dejavnik za uspeh peptidnih poskusov. Nepravilno raztapljanje bo povzročilo izgubo peptidov in neuspeh poskusa. Vendar, iskanje idealne metode raztapljanja je včasih precej zahtevno. Sledijo metode raztapljanja, ki sta jih predlagali dve tehnični skupini MOL Changes. metoda
Vodnik za razpustitev tehnološke skupine MOL spremeni
Glavna težava pri raztapljanju peptidov je tvorba sekundarne strukture.
Čeprav je tvorba sekundarnih struktur hidrofobnih peptidnih verig bolj očitna, razen najkrajših peptidnih verig, ta pojav se pojavlja v skoraj vseh peptidnih verigah, ne glede na polariteto. Zato, prvo načelo raztapljanja polipeptidov je uporaba sterilne destilirane vode ali deionizirane vode (ali vodo brez kisika, če razmere to dopuščajo).
Peptidna raztopina lahko naleti na bakterijsko razgradnjo. Da bi se izognili temu pojavu, peptid je treba raztopiti v sterilni destilirani vodi, ali filtriramo s filtrirno membrano z velikostjo por 0.45 oz 0.2 μm za sterilizacijo. Polipeptidi, ki vsebujejo Cys, Met, in Trp sta še posebej dovzetna za oksidacijo, zato jih je treba raztopiti v vodi brez kisika. Vodo brez kisika lahko dobimo z razplinjevanjem pod znižanim tlakom z vbrizgavanjem inertnih plinov (dušik, helij, in argon).
Če je peptid netopen v čisti vodi, ultrazvočna obdelava lahko pomaga razbiti delce in povečati topnost. Opomba: Ultrazvočna obdelava bo povzročila segrevanje raztopine in razgradnjo peptida.
Če peptid vsebuje več bazičnih aminokislin, uporabite 1~10% vodno raztopino ocetne kisline; za zelo hidrofobne peptide, uporaba 50% ocetna kislina.
Če polipeptid vsebuje veliko količino kislih aminokislin, lahko se raztopi v a 1 do 10% raztopina amoniaka ali hlapni alkalni pufer, kot je etil morfin acetat ali bikarbonat. Vrednost pH je treba prilagoditi pred kromatografijo.
Če naj se peptid naloži na kolono, količina organskega topila mora biti zelo majhna, drugače bo retencijski čas resno prizadet.
Če je polipeptid zelo hidrofoben, ker vsebuje stranske verige aromatskih ogljikovodikov, kot je Val, Leu, Met, Phe, Tyr, Ala, itd., ali je nevtralni peptid, uporaba membranskih denaturantov, kot sta DMF ali DMSO, lahko pomaga raztopiti polipeptid:
a. Visokokoncentrirani membranski denaturanti pomagajo raztapljati polipeptid z uničenjem njegove sekundarne strukture.
b. Membranski denaturanti so primerni za pripravo raztopin za analizo peptidov, vendar lahko moti raziskave o njihovi biološki aktivnosti.
c. DMF je najboljši denaturant (največjo koncentracijo, ki jo lahko doseže 30%), in dodajamo po kapljicah, dokler se peptid ne raztopi.
d. Med kromatografijo z reverzno fazo, DMF bo iztekel skupaj s sprednjim vrhom eluenta. Odvisno od količine vbrizga, najvišja vrednost je lahko zelo visoka. Večina peptidov se lahko eluira v nekaj minutah po eluiranju velike količine DMF. Če je peptidna veriga majhna in se eluira prezgodaj, količina peptida se bo zmanjšala.
MOL spreminja navodila za razpustitev tehnične skupine II
Kako ugotoviti, ali so aminokisline nevtralne, kislo ali bazično, in izračunajte metodo raztapljanja:
1. Določite vsako kislo aminokislino v polipeptidnem zaporedju, vključno z asparaginsko kislino Asp (D), glutaminska kislina Glu (E) in C-terminalni karboksil-COOH kot -1; vsaka osnovna aminokislina, vključno z argininom Arg ( R), lizin Lys (K), histidin His (H) in N-terminalnemu amino-NH2 pripišemo vrednost +1; nevtralne aminokisline so 0. Na podlagi tega, izračuna se vrednost celotnega polipeptida, in rezultat je pozitiven. Peptide z negativnim rezultatom imenujemo bazični peptidi, tiste z negativnim rezultatom imenujemo kisli peptidi, tiste z rezultatom nič pa imenujemo nevtralni peptidi.
2. Če gre za alkalni peptid, poskusite ga najprej raztopiti z vodo; če se ne da raztopiti, poskusite uporabiti 10% – 30% ocetna kislina; če je peptid še vedno netopen, poskusite uporabiti čisto ocetno kislino in trifluoroocetno kislino TFA (<50 μl) da ga raztopimo, in nato raztopino peptida razredčite na želeno koncentracijo.
3. Če gre za kisel peptid, poskusite ga najprej raztopiti z vodo; če ga ni mogoče raztopiti z vodo, poskusite uporabiti 13% amoniakova voda (v/v) da ga raztopimo, in raztopino peptida razredčite na zahtevano koncentracijo. Če peptidno zaporedje vsebuje cistein Cys (C), ni ga mogoče raztopiti v alkalni raztopini. Poskusite s spodnjimi metodami.
4. Nevtralni peptidi so običajno raztopljeni v organskih topilih. najprej, poskusite uporabiti acetonitril (acetonitril), ali metanol (metanol) ali izopropanol (izopropanol) raztopiti se; za zelo hidrofobne peptide, najprej raztopite z majhno količino dimetil sulfoksida (DMSO) in razredčite z vodo do zahtevane koncentracije; če peptidno zaporedje vsebuje cistein Cys (C), uporabite dimetilformamid (DMF) ali N-metilpirolidon (NMP) za razpustitev. Za peptide, ki so nagnjeni k agregaciji, najprej dodajte 6M gvanidin·HCl ali 8M sečnino (Urea) da jih raztopimo, in jih nato razredčite do želene koncentracije.
ilustrirati:
1. Za lažje shranjevanje in kasnejšo uporabo, priporočljivo je, da se peptid raztopi do koncentracije približno 1-2 mg/ml.
2. Navadni peptidni liofilizirani prah se lahko hrani pri -20°C več kot eno leto. Za raztopljene peptide, priporočljivo je alikvotiranje in shranjevanje pri -20°C; če peptidno zaporedje vsebuje metionin Met (M), cisteinska kislina Cys (C) ali tirozin Tyr (Y) Priporočljivo je, da se hrani v okolju brez kisika, da se prepreči oksidacija.
Priložen seznam aminokislin:
1.Nevtralne aminokisline: glicin, alanin, levcin, izolevcin, valin, cistein, metionin, treonin, serin, fenilalanin, tirozin, triptofanska kislina, prolin, asparagin in glutamin
Features: Ta vrsta molekule aminokisline vsebuje samo eno amino skupino in eno karboksilno skupino
2.Kisle aminokisline: glutaminska kislina, asparaginska kislina
Lastnosti: Ta vrsta molekule aminokisline vsebuje eno amino skupino in dve karboksilni skupini
3.Bazične aminokisline: lizin, arginin, histidin
Lastnosti: Ta vrsta aminokislin vsebuje diaminokarboksilno skupino v svoji molekuli; histidin ima dušikov obroč in je šibko alkalen, in je tudi bazična aminokislina.
