Passende opløsningsmetode er en vigtig faktor for succes med peptideksperimenter. Forkert opløsning vil forårsage tab af peptider og fejl i eksperimentet. Imidlertid, at finde den ideelle opløsningsmetode er nogle gange ret udfordrende. Følgende er opløsningsmetoderne foreslået af de to tekniske grupper af MOL Changes. metode
MOL Changes Technology Group Opløsningsvejledning
Hovedproblemet i peptidopløsning er dannelsen af sekundær struktur.
Selvom dannelsen af sekundære strukturer af hydrofobe peptidkæder er mere indlysende, bortset fra de korteste peptidkæder, dette fænomen forekommer i næsten alle peptidkæder, uanset polaritet. Derfor, det første princip for opløsning af polypeptider er at bruge sterilt destilleret vand eller deioniseret vand (eller iltfrit vand, hvis forholdene tillader det).
Peptidopløsningen kan støde på bakteriel nedbrydning. For at undgå dette fænomen, peptidet skal opløses i sterilt destilleret vand, eller filtreret med en filtermembran med en porestørrelse på 0.45 eller 0.2 μm til sterilisering. Polypeptider indeholdende Cys, Opfyldt, og Trp er særligt modtagelige for oxidation, så de skal opløses i iltfrit vand. Iltfrit vand kan opnås ved afgasning under reduceret tryk ved indsprøjtning af inerte gasser (nitrogen, helium, og argon).
Hvis peptidet er uopløseligt i rent vand, ultralydsbehandling kan hjælpe med at bryde partiklerne op og øge opløseligheden. Note: Ultralydsbehandling vil forårsage opvarmning af opløsningen og nedbrydning af peptidet.
Hvis peptidet indeholder flere basiske aminosyrer, brug 1~10% vandig eddikesyreopløsning; til meget hydrofobe peptider, bruge 50% eddikesyre.
Hvis polypeptidet indeholder en stor mængde sure aminosyrer, det kan opløses i en 1 til 10% ammoniakopløsning eller en flygtig alkalisk buffer såsom ethylmorfinacetat eller bicarbonat. pH-værdien skal justeres før kromatografi.
Hvis peptidet skal påføres søjlen, mængden af organisk opløsningsmiddel skal være meget lille, ellers vil opholdstiden blive alvorligt påvirket.
Hvis polypeptidet er meget hydrofobt, fordi det indeholder aromatiske carbonhydridsidekæder, såsom Val, Leu, Opfyldt, Phe, Tyr, Ala, osv., eller er et neutralt peptid, brugen af membrandenatureringsmidler såsom DMF eller DMSO kan hjælpe med at opløse polypeptidet:
-en. Højkoncentrationsmembrandenatureringsmidler hjælper med at opløse polypeptidet ved at ødelægge dets sekundære struktur.
b. Membrandenatureringsmidler er egnede til fremstilling af peptidanalyseopløsninger, men kan forstyrre forskning i deres biologiske aktivitet.
c. DMF er det bedste denatureringsmiddel (den højeste koncentration kan nå 30%), og tilsættes dråbevis, indtil peptidet er opløst.
d. Under omvendt fase kromatografi, DMF vil flyde ud sammen med den forreste top af eluenten. Afhængig af injektionsvolumen, spidsværdien kan være meget høj. De fleste peptider kan eluere inden for få minutter efter at en stor mængde DMF er elueret. Hvis peptidkæden er lille og eluerer for tidligt, mængden af peptidet vil blive reduceret.
MOL Ændringer Teknisk Gruppe II Opløsningsvejledning
Hvordan man skelner om aminosyrer er neutrale, sur eller basisk, og beregn opløsningsmetoden:
1. Tildel hver sur aminosyre i polypeptidsekvensen inklusive asparaginsyre Asp (D), glutaminsyre Glu (E) og C-terminal carboxyl-COOH as -1; hver basisk aminosyre inklusive arginin Arg ( R), lysin Lys (K), histidin His (H) og den N-terminale amino-NH2 tildeles en værdi på +1; neutrale aminosyrer er 0. Baseret på dette, værdien af hele polypeptidet beregnes, og scoren er positiv Peptider med negativ score kaldes basispeptider, dem med en negativ score kaldes sure peptider, og dem med en score på nul kaldes neutrale peptider.
2. Hvis det er et alkalisk peptid, prøv først at opløse det med vand; hvis det ikke kan opløses, prøv at bruge 10% – 30% eddikesyre; hvis peptidet stadig er uopløseligt, prøv at bruge ren eddikesyre og trifluoreddikesyre TFA (<50 μl) at opløse det, og fortynd derefter peptidopløsningen til den ønskede koncentration.
3. Hvis det er et surt peptid, prøv først at opløse det med vand; hvis det ikke kan opløses med vand, prøv at bruge 13% ammoniak vand (v/v) at opløse det, og fortynd peptidopløsningen til den nødvendige koncentration. Hvis peptidsekvensen indeholder cystein Cys (C), det kan ikke opløses i alkalisk opløsning. Prøv venligst nedenstående metoder.
4. Neutrale peptider opløses normalt i organiske opløsningsmidler. Først, prøv at bruge acetonitril (acetonitril), eller methanol (methanol) eller isopropanol (isopropanol) at opløse; til meget hydrofobe peptider, først opløses med en lille mængde dimethylsulfoxid (DMSO) og fortynd med vand til den ønskede koncentration; hvis peptidsekvensen indeholder cystein Cys (C), brug dimethylformamid (DMF) eller N-methylpyrrolidon (NMP) til opløsning. Til peptider, der er tilbøjelige til at aggregere, tilsæt først 6M guanidin·HCl eller 8M urinstof (Urinstof) at opløse dem, og fortynd dem derefter til den ønskede koncentration.
illustrere:
1. For at lette opbevaring og efterfølgende brug, det anbefales at opløse peptidet til en koncentration på ca 1-2 mg/ml.
2. Almindelig peptid frysetørret pulver kan opbevares ved -20°C i mere end et år. Til opløste peptider, det anbefales at alikvotere og opbevares ved -20°C; hvis peptidsekvensen indeholder methionin Met (M), cysteinsyre Cys (C) eller tyrosin Tyr (Y) anbefales at opbevares i et iltfrit miljø for at forhindre oxidation.
Vedhæftet aminosyreliste:
1.Neutrale aminosyrer: glycin, alanin, leucin, isoleucin, valine, cystein, methionin, threonin, serin, phenylalanin, tyrosin, tryptofansyre, prolin, asparagin og glutamin
Features: Denne type aminosyremolekyle indeholder kun én aminogruppe og én carboxylgruppe
2.Sure aminosyrer: glutaminsyre, asparaginsyre
Funktioner: Denne type aminosyremolekyle indeholder en aminogruppe og to carboxylgrupper
3.Grundlæggende aminosyrer: lysin, arginin, histidin
Funktioner: Denne type aminosyre indeholder en diaminocarboxylgruppe i sit molekyle; histidin har en nitrogenring og er svagt basisk, og er også en basisk aminosyre.
