El método de disolución apropiado es un factor importante para el éxito de los experimentos con péptidos.. Una disolución inadecuada provocará la pérdida de péptidos y el fracaso del experimento.. Sin embargo, encontrar el método de disolución ideal a veces es todo un desafío. Los siguientes son los métodos de disolución propuestos por los dos grupos técnicos de MOL Cambios. método
Guía de disolución del grupo tecnológico de cambios MOL
El principal problema en la disolución de péptidos es la formación de una estructura secundaria..
Aunque la formación de estructuras secundarias de cadenas peptídicas hidrófobas es más obvia, excepto las cadenas peptídicas más cortas., Este fenómeno ocurre en casi todas las cadenas peptídicas., independientemente de la polaridad. Por lo tanto, El primer principio para disolver polipéptidos es utilizar agua destilada estéril o agua desionizada. (o agua libre de oxígeno si las condiciones lo permiten).
La solución peptídica puede sufrir degradación bacteriana.. Para evitar este fenómeno, El péptido debe disolverse en agua destilada estéril., o filtrarse con una membrana filtrante con un tamaño de poro de 0.45 o 0.2 μm para esterilización. Polipéptidos que contienen Cys, Cumplió, y Trp son particularmente susceptibles a la oxidación., por lo que deben disolverse en agua sin oxígeno.. Se puede obtener agua libre de oxígeno desgasificándola a presión reducida mediante la inyección de gases inertes. (nitrógeno, helio, y argón).
Si el péptido es insoluble en agua pura., El tratamiento ultrasónico puede ayudar a romper las partículas y aumentar la solubilidad.. Nota: El tratamiento ultrasónico provocará el calentamiento de la solución y la degradación del péptido..
Si el péptido contiene múltiples aminoácidos básicos, Utilice una solución acuosa de ácido acético del 1 al 10 %.; para péptidos muy hidrofóbicos, usar 50% ácido acético.
Si el polipéptido contiene una gran cantidad de aminoácidos ácidos., se puede disolver en un 1 a 10% solución de amoníaco o un tampón alcalino volátil como acetato o bicarbonato de etilmorfina. El valor del pH debe ajustarse antes de la cromatografía..
Si el péptido se va a cargar en la columna, La cantidad de disolvente orgánico debe ser muy pequeña., De lo contrario, el tiempo de retención se verá seriamente afectado..
Si el polipéptido es altamente hidrófobo porque contiene cadenas laterales de hidrocarburos aromáticos como Val, leu, Cumplió, phe, tiro, ala, etc., o es un péptido neutro, el uso de desnaturalizantes de membrana como DMF o DMSO puede ayudar a disolver el polipéptido:
a. Los desnaturalizantes de membrana de alta concentración ayudan a disolver el polipéptido destruyendo su estructura secundaria..
b. Los desnaturalizantes de membrana son adecuados para la preparación de soluciones de análisis de péptidos., pero puede interferir con la investigación sobre su actividad biológica.
do. DMF es el mejor desnaturalizante (la concentración más alta puede alcanzar 30%), y se añade gota a gota hasta que el péptido se disuelva.
d. Durante la cromatografía de fase reversa, El DMF fluirá junto con el pico frontal del eluyente.. Dependiendo del volumen de inyección, el valor máximo puede ser muy alto. La mayoría de los péptidos pueden eludir unos minutos después de que eluya una gran cantidad de DMF.. Si la cadena peptídica es pequeña y eluye demasiado pronto, la cantidad del péptido se reducirá.
Guía de Disolución del Grupo Técnico II de Cambios MOL
Cómo distinguir si los aminoácidos son neutros, ácido o alcalino, y calcular el método de disolución:
1. Asigne cada aminoácido ácido en la secuencia polipeptídica, incluido el ácido aspártico Asp. (D), ácido glutámico Glu (mi) y carboxil-COOH C-terminal como -1; cada aminoácido básico incluida la arginina Arg ( R), lisina lys (k), histidina su (h) y al amino-NH2 N-terminal se les asigna un valor de +1; Los aminoácidos neutros son 0. Basado en esto, se calcula el valor del polipéptido completo, y la puntuación es positiva. Los péptidos con una puntuación negativa se denominan péptidos básicos., aquellos con una puntuación negativa se llaman péptidos ácidos, y aquellos con una puntuación de cero se llaman péptidos neutros.
2. Si es un péptido alcalino, Intenta disolverlo con agua primero.; si no se puede disolver, intenta usar 10% – 30% ácido acético; si el péptido aún es insoluble, Intente utilizar ácido acético puro y ácido trifluoroacético TFA. (<50 µl) para disolverlo, y luego diluya la solución de péptidos a la concentración deseada.
3. Si es un péptido ácido, Intenta disolverlo con agua primero.; si no se puede disolver con agua, intenta usar 13% agua con amoníaco (v/v) para disolverlo, y diluir la solución de péptidos a la concentración requerida. Si la secuencia peptídica contiene cisteína Cys (do), no se puede disolver en solución alcalina. Pruebe los métodos siguientes.
4. Los péptidos neutros suelen estar disueltos en disolventes orgánicos.. Primero, intenta usar acetonitrilo (acetonitrilo), o metanol (metanol) o isopropanol (isopropanol) disolver; para péptidos muy hidrofóbicos, primero disolver con una pequeña cantidad de dimetilsulfóxido (DMSO) y diluir con agua hasta la concentración requerida; si la secuencia peptídica contiene cisteína Cys (do), usar dimetilformamida (DMF) o N-metilpirrolidona (NMP) para disolución. Para péptidos que son propensos a la agregación, primero agregue guanidina 6 M · HCl o urea 8 M (Urea) para disolverlos, y luego diluirlos a la concentración requerida.
ilustrar:
1. Para facilitar el almacenamiento y uso posterior, se recomienda disolver el péptido a una concentración de aproximadamente 1-2 mg/ml.
2. El polvo liofilizado de péptido común se puede almacenar a -20 °C durante más de un año. Para péptidos disueltos, se recomienda dividir en alícuotas y almacenar a -20°C; si la secuencia peptídica contiene metionina Met (METRO), ácido cisteína cys (do) o tirosina Tyr (Y) Se recomienda almacenarlo en un ambiente libre de oxígeno para evitar la oxidación..
Lista de aminoácidos adjunta:
1.Aminoácidos neutros: glicina, alanina, leucina, isoleucina, valina, cisteína, metionina, treonina, serina, fenilalanina, tirosina, ácido triptófano, prolina, asparagina y glutamina
Fcaracterísticas: Este tipo de molécula de aminoácido contiene solo un grupo amino y un grupo carboxilo.
2.Aminoácidos ácidos: ácido glutámico, ácido aspártico
Características: Este tipo de molécula de aminoácido contiene un grupo amino y dos grupos carboxilo.
3.aminoácidos básicos: lisina, arginina, histidina
Características: Este tipo de aminoácido contiene un grupo diaminocarboxilo en su molécula.; La histidina tiene un anillo de nitrógeno y es débilmente alcalina., y también es un aminoácido básico.
