Phương pháp hòa tan phù hợp là yếu tố quan trọng cho sự thành công của thí nghiệm peptide. Việc hòa tan không đúng cách sẽ gây mất peptide và thất bại của thí nghiệm. Tuy nhiên, việc tìm kiếm phương pháp giải thể lý tưởng đôi khi khá khó khăn. Sau đây là các phương pháp giải thể do 2 nhóm kỹ thuật của MOL Changes đề xuất. phương pháp
Hướng dẫn Giải thể Tập đoàn Công nghệ MOL Changes
Vấn đề chính trong quá trình hòa tan peptide là sự hình thành cấu trúc bậc hai.
Mặc dù sự hình thành cấu trúc bậc hai của chuỗi peptide kỵ nước rõ ràng hơn, ngoại trừ chuỗi peptide ngắn nhất, Hiện tượng này xảy ra ở hầu hết các chuỗi peptide, bất kể cực tính. Vì thế, Nguyên tắc hòa tan polypeptide đầu tiên là sử dụng nước cất vô trùng hoặc nước khử ion (hoặc nước không có oxy nếu điều kiện cho phép).
Dung dịch peptide có thể gặp phải sự phân hủy của vi khuẩn. Để tránh hiện tượng này, peptide nên được hòa tan trong nước cất vô trùng, hoặc lọc bằng màng lọc có kích thước lỗ 0.45 hoặc 0.2 μm để khử trùng. Polypeptide chứa Cys, Đã gặp, và Trp đặc biệt dễ bị oxy hóa, vì vậy chúng nên được hòa tan trong nước không có oxy. Nước không có oxy có thể thu được bằng cách khử khí dưới áp suất giảm bằng cách bơm khí trơ (nitơ, khí heli, và argon).
Nếu peptit không tan trong nước tinh khiết, xử lý siêu âm có thể giúp phá vỡ các hạt và tăng độ hòa tan. Ghi chú: Xử lý siêu âm sẽ làm nóng dung dịch và làm suy giảm peptide.
Nếu peptit chứa nhiều axit amin cơ bản, sử dụng dung dịch nước axit axetic 1 ~ 10%; đối với các peptit rất kỵ nước, sử dụng 50% axit axetic.
Nếu polypeptide chứa một lượng lớn axit amin có tính axit, nó có thể được hòa tan trong một 1 ĐẾN 10% dung dịch amoniac hoặc dung dịch đệm kiềm dễ bay hơi như ethyl morphin axetat hoặc bicarbonate. Giá trị pH phải được điều chỉnh trước khi sắc ký.
Nếu peptide được đưa lên cột, lượng dung môi hữu cơ phải rất nhỏ, nếu không thời gian lưu sẽ bị ảnh hưởng nghiêm trọng.
Nếu polypeptide có tính kỵ nước cao vì nó chứa các chuỗi bên hydrocacbon thơm như Val, Lê, Đã gặp, phe, Tyr, ôi, vân vân., hoặc là peptit trung tính, việc sử dụng các chất biến tính màng như DMF hoặc DMSO có thể giúp hòa tan polypeptide:
Một. Chất khử chất màng nồng độ cao giúp hòa tan polypeptide bằng cách phá hủy cấu trúc thứ cấp của nó.
b. Chất khử chất màng thích hợp cho việc chuẩn bị các dung dịch phân tích peptide, nhưng có thể cản trở việc nghiên cứu hoạt động sinh học của chúng.
c. DMF là chất biến tính tốt nhất (nồng độ cao nhất có thể đạt được 30%), và được thêm từng giọt cho đến khi peptit được hòa tan.
d. Trong quá trình sắc ký pha đảo, DMF sẽ chảy ra cùng với đỉnh trước của dung dịch rửa giải. Tùy thuộc vào lượng phun, giá trị đỉnh có thể rất cao. Hầu hết các peptide có thể rửa giải trong vòng vài phút sau khi rửa giải một lượng lớn DMF. Nếu chuỗi peptide nhỏ và rửa giải quá sớm, lượng peptit sẽ giảm.
Hướng dẫn Giải thể Nhóm II Kỹ thuật MOL
Cách phân biệt axit amin trung tính, axit hoặc kiềm, và tính phương pháp hòa tan:
1. Chỉ định từng axit amin axit trong chuỗi polypeptide bao gồm axit aspartic Asp (D), axit glutamic (E) và đầu C carboxyl-COOH là -1; mỗi axit amin cơ bản bao gồm arginine Arg ( R), lysine Lys (K), histidine của anh ấy (H) và đầu N amino-NH2 được gán giá trị là +1; axit amin trung tính là 0. Dựa trên điều này, giá trị của toàn bộ polypeptide được tính toán, và điểm là dương. Peptide có điểm âm được gọi là peptide cơ bản, những chất có điểm âm được gọi là peptide axit, và những chất có điểm 0 được gọi là peptide trung tính.
2. Nếu là peptide kiềm, cố gắng hòa tan nó với nước trước; nếu không thể hòa tan được, cố gắng sử dụng 10% – 30% axit axetic; nếu peptide vẫn không hòa tan, cố gắng sử dụng axit axetic tinh khiết và axit trifluoroacetic TFA (<50 ul) để hòa tan nó, và sau đó Pha loãng dung dịch peptide đến nồng độ mong muốn.
3. Nếu là peptit có tính axit, cố gắng hòa tan nó với nước trước; nếu nó không thể hòa tan với nước, cố gắng sử dụng 13% nước amoniac (v/v) để hòa tan nó, và pha loãng dung dịch peptit đến nồng độ cần thiết. Nếu trình tự peptit chứa cystein Cys (C), nó không thể hòa tan trong dung dịch kiềm. Hãy thử các phương pháp dưới đây.
4. Peptide trung tính thường được hòa tan trong dung môi hữu cơ. Đầu tiên, thử dùng acetonitril (axetonitril), hoặc metanol (metanol) hoặc isopropanol (isopropanol) hòa tan; đối với các peptit rất kỵ nước, đầu tiên hòa tan với một lượng nhỏ dimethyl sulfoxide (DMSO) và pha loãng bằng nước đến nồng độ cần thiết; nếu trình tự peptide chứa cystein Cys (C), sử dụng dimethylformamid (DMF) hoặc N-metylpyrolidon (NMP) để giải thể. Đối với các peptide dễ bị kết tụ, đầu tiên thêm 6M guanidine·HCl hoặc 8M urê (urê) để hòa tan chúng, rồi pha loãng đến nồng độ cần thiết.
minh họa:
1. Để thuận tiện cho việc bảo quản và sử dụng sau này, nên hòa tan peptide đến nồng độ khoảng 1-2 mg/ml.
2. Bột đông khô peptide thông thường có thể được bảo quản ở -20°C trong hơn một năm. Đối với peptide hòa tan, nên chia nhỏ và bảo quản ở -20°C; nếu trình tự peptide chứa methionine Met (M), Cys axit cystein (C) hoặc tyrosine Tyr (Y) được khuyến khích bảo quản trong môi trường không có oxy để ngăn chặn quá trình oxy hóa.
Danh sách axit amin đính kèm:
1.Axit amin trung tính: glyxin, alanin, leucine, isoleuxin, valin, cystein, methionin, threonin, serine, phenylalanin, tyrosin, axit tryptophan, prolin, asparagine và glutamine
Fđồ ăn: Loại phân tử axit amin này chỉ chứa một nhóm amin và một nhóm cacboxyl
2.Axit amin axit: axit glutamic, axit aspartic
Đặc trưng: Loại phân tử axit amin này chứa một nhóm amin và hai nhóm cacboxyl
3.Axit amin cơ bản: lysine, arginin, histidin
Đặc trưng: Loại axit amin này chứa nhóm diaminocarboxyl trong phân tử của nó; histidine có vòng nitơ và có tính kiềm yếu, và cũng là một axit amin cơ bản.
