पेप्टाइड प्रयोगों की सफलता के लिए उचित विघटन विधि एक महत्वपूर्ण कारक है. अनुचित विघटन से पेप्टाइड्स की हानि होगी और प्रयोग विफल हो जाएगा. तथापि, आदर्श विघटन विधि ढूँढना कभी-कभी काफी चुनौतीपूर्ण होता है. एमओएल परिवर्तन के दो तकनीकी समूहों द्वारा प्रस्तावित विघटन विधियां निम्नलिखित हैं. तरीका
एमओएल परिवर्तन प्रौद्योगिकी समूह विघटन गाइड
पेप्टाइड विघटन में मुख्य समस्या द्वितीयक संरचना का निर्माण है.
यद्यपि हाइड्रोफोबिक पेप्टाइड श्रृंखलाओं की द्वितीयक संरचनाओं का निर्माण अधिक स्पष्ट है, सबसे छोटी पेप्टाइड श्रृंखलाओं को छोड़कर, यह घटना लगभग सभी पेप्टाइड श्रृंखलाओं में होती है, ध्रुवीयता की परवाह किए बिना. इसलिए, पॉलीपेप्टाइड्स को घोलने का पहला सिद्धांत बाँझ आसुत जल या विआयनीकृत जल का उपयोग करना है (या यदि परिस्थितियाँ अनुमति दें तो ऑक्सीजन मुक्त पानी).
पेप्टाइड समाधान में जीवाणु क्षरण हो सकता है. इस घटना से बचने के लिए, पेप्टाइड को बाँझ आसुत जल में घोलना चाहिए, या एक छिद्र आकार के साथ एक फिल्टर झिल्ली के साथ फ़िल्टर किया गया 0.45 या 0.2 नसबंदी के लिए μm. Cys युक्त पॉलीपेप्टाइड्स, मिले, और टीआरपी ऑक्सीकरण के प्रति विशेष रूप से संवेदनशील हैं, इसलिए उन्हें ऑक्सीजन रहित पानी में घोलना चाहिए. अक्रिय गैसों को इंजेक्ट करके कम दबाव में डीगैसिंग करके ऑक्सीजन मुक्त पानी प्राप्त किया जा सकता है (नाइट्रोजन, हीलियम, और आर्गन).
यदि पेप्टाइड शुद्ध पानी में अघुलनशील है, अल्ट्रासोनिक उपचार कणों को तोड़ने और घुलनशीलता बढ़ाने में मदद कर सकता है. टिप्पणी: अल्ट्रासोनिक उपचार से घोल गर्म हो जाएगा और पेप्टाइड का क्षरण हो जाएगा.
यदि पेप्टाइड में कई बुनियादी अमीनो एसिड होते हैं, 1~10% एसिटिक एसिड जलीय घोल का उपयोग करें; अत्यधिक हाइड्रोफोबिक पेप्टाइड्स के लिए, उपयोग 50% एसीटिक अम्ल.
यदि पॉलीपेप्टाइड में बड़ी मात्रा में अम्लीय अमीनो एसिड होते हैं, इसे एक में विघटित किया जा सकता है 1 को 10% अमोनिया समाधान या एक वाष्पशील क्षारीय बफर जैसे एथिल मॉर्फिन एसीटेट या बाइकार्बोनेट. क्रोमैटोग्राफी से पहले पीएच मान को समायोजित किया जाना चाहिए.
यदि पेप्टाइड को कॉलम पर लोड किया जाना है, कार्बनिक विलायक की मात्रा बहुत कम होनी चाहिए, अन्यथा अवधारण समय गंभीर रूप से प्रभावित होगा.
यदि पॉलीपेप्टाइड अत्यधिक हाइड्रोफोबिक है क्योंकि इसमें वैल जैसी सुगंधित हाइड्रोकार्बन साइड चेन शामिल हैं, लियू, मिले, पीएचई, टायर, अला, वगैरह।, या एक तटस्थ पेप्टाइड है, डीएमएफ या डीएमएसओ जैसे झिल्ली विकृतियों का उपयोग पॉलीपेप्टाइड को भंग करने में मदद कर सकता है:
ए. उच्च-सांद्रता झिल्ली विकृतीकरण पॉलीपेप्टाइड की द्वितीयक संरचना को नष्ट करके उसे घोलने में मदद करते हैं.
बी. झिल्ली विकृतीकरण पेप्टाइड विश्लेषण समाधान तैयार करने के लिए उपयुक्त हैं, लेकिन उनकी जैविक गतिविधि पर अनुसंधान में हस्तक्षेप हो सकता है.
सी. डीएमएफ सर्वोत्तम डिनैचुरेंट है (उच्चतम सांद्रता तक पहुँच सकते हैं 30%), और पेप्टाइड घुलने तक बूंद-बूंद करके डाला जाता है.
डी. उलट-चरण क्रोमैटोग्राफी के दौरान, डीएमएफ एलुएंट के सामने के शिखर के साथ मिलकर बाहर निकलेगा. इंजेक्शन की मात्रा पर निर्भर करता है, शिखर मान बहुत अधिक हो सकता है. बड़ी मात्रा में डीएमएफ के निष्कासन के बाद अधिकांश पेप्टाइड्स कुछ ही मिनटों में समाप्त हो सकते हैं. यदि पेप्टाइड श्रृंखला छोटी है और बहुत जल्दी समाप्त हो जाती है, पेप्टाइड की मात्रा कम हो जाएगी.
एमओएल परिवर्तन तकनीकी समूह II विघटन गाइड
कैसे भेद करें कि अमीनो एसिड तटस्थ हैं या नहीं, अम्लीय या क्षारीय, और विघटन विधि की गणना करें:
1. एस्पार्टिक एसिड एएसपी सहित पॉलीपेप्टाइड अनुक्रम में प्रत्येक अम्लीय अमीनो एसिड निर्दिष्ट करें (डी), ग्लूटामिक एसिड ग्लू (ई) और सी-टर्मिनल कार्बोक्सिल-सीओओएच के रूप में -1; आर्जिनिन Arg सहित प्रत्येक मूल अमीनो एसिड ( आर), लाइसिन लिस (के), हिस्टिडाइन उसका (एच) और एन-टर्मिनल अमीनो-एनएच2 को एक मान दिया गया है +1; तटस्थ अमीनो एसिड हैं 0. इसके आधार पर, संपूर्ण पॉलीपेप्टाइड के मूल्य की गणना की जाती है, और स्कोर सकारात्मक है। नकारात्मक स्कोर वाले पेप्टाइड्स को बेसिक पेप्टाइड्स कहा जाता है, नकारात्मक स्कोर वाले लोगों को अम्लीय पेप्टाइड्स कहा जाता है, और जिनका स्कोर शून्य होता है उन्हें तटस्थ पेप्टाइड्स कहा जाता है.
2. यदि यह एक क्षारीय पेप्टाइड है, पहले इसे पानी से घोलने का प्रयास करें; यदि इसे विघटित नहीं किया जा सकता है, उपयोग करने का प्रयास करें 10% – 30% एसीटिक अम्ल; यदि पेप्टाइड अभी भी अघुलनशील है, शुद्ध एसिटिक एसिड और ट्राइफ्लूरोएसेटिक एसिड टीएफए का उपयोग करने का प्रयास करें (<50 μl) इसे भंग करने के लिए, और फिर पेप्टाइड घोल को वांछित सांद्रता तक पतला करें.
3. यदि यह एक अम्लीय पेप्टाइड है, पहले इसे पानी से घोलने का प्रयास करें; यदि इसे पानी में नहीं घोला जा सकता, उपयोग करने का प्रयास करें 13% अमोनिया पानी (वी/वी) इसे भंग करने के लिए, और पेप्टाइड घोल को आवश्यक सांद्रता तक पतला करें. यदि पेप्टाइड अनुक्रम में सिस्टीन Cys शामिल है (सी), इसे क्षारीय घोल में नहीं घोला जा सकता. कृपया नीचे दिए गए तरीकों को आज़माएँ.
4. तटस्थ पेप्टाइड्स आमतौर पर कार्बनिक सॉल्वैंट्स में घुल जाते हैं. पहला, एसीटोनिट्राइल का उपयोग करने का प्रयास करें (acetonitrile), या मेथनॉल (मेथनॉल) या आइसोप्रोपेनॉल (isopropanol) घुलना; अत्यधिक हाइड्रोफोबिक पेप्टाइड्स के लिए, पहले डाइमिथाइल सल्फ़ोक्साइड की थोड़ी मात्रा के साथ घोलें (डीएमएसओ) और आवश्यक सांद्रता तक पानी से पतला करें; यदि पेप्टाइड अनुक्रम में सिस्टीन Cys शामिल है (सी), डाइमिथाइलफॉर्मामाइड का उपयोग करें (डीएमएफ) या एन-मिथाइलपाइरोलिडोन (एन एम पी) विघटन के लिए. पेप्टाइड्स के लिए जो एकत्रीकरण के लिए प्रवण हैं, सबसे पहले 6M गुआनिडाइन·HCl या 8M यूरिया डालें (यूरिया) उन्हें भंग करने के लिए, और फिर उन्हें आवश्यक सांद्रता तक पतला कर लें.
उदाहरण देकर स्पष्ट करना:
1. भंडारण और उसके बाद के उपयोग को सुविधाजनक बनाने के लिए, पेप्टाइड को लगभग की सांद्रता तक घोलने की अनुशंसा की जाती है 1-2 मिलीग्राम/एमएल.
2. साधारण पेप्टाइड फ़्रीज़-सूखे पाउडर को -20°C पर एक वर्ष से अधिक समय तक संग्रहीत किया जा सकता है. घुले हुए पेप्टाइड्स के लिए, इसे -20°C पर विभाज्य और भण्डारित करने की अनुशंसा की जाती है; यदि पेप्टाइड अनुक्रम में मेथिओनिन मेट शामिल है (एम), सिस्टीन एसिड Cys (सी) या टायरोसिन टायर (वाई) ऑक्सीकरण को रोकने के लिए इसे ऑक्सीजन मुक्त वातावरण में संग्रहित करने की अनुशंसा की जाती है.
अमीनो एसिड सूची संलग्न:
1.तटस्थ अमीनो एसिड: ग्लाइसिन, ऐलेनिन, ल्यूसीन, आइसोल्यूसीन, वेलिन, सिस्टीन, मेथिओनिन, threonine, सेरीन, फेनिलएलनिन, टायरोसिन, ट्रिप्टोफैन एसिड, PROLINE, शतावरी और ग्लूटामाइन
एफभोजन: इस प्रकार के अमीनो एसिड अणु में केवल एक अमीनो समूह और एक कार्बोक्सिल समूह होता है
2.अम्लीय अमीनो एसिड: ग्लुटामिक एसिड, एसपारटिक अम्ल
विशेषताएँ: इस प्रकार के अमीनो एसिड अणु में एक अमीनो समूह और दो कार्बोक्सिल समूह होते हैं
3.मूल अमीनो एसिड: लाइसिन, arginine, हिस्टडीन
विशेषताएँ: इस प्रकार के अमीनो एसिड के अणु में एक डायमिनोकार्बोक्सिल समूह होता है; हिस्टिडाइन में नाइट्रोजन वलय होता है और यह कमजोर रूप से क्षारीय होता है, और यह एक बुनियादी अमीनो एसिड भी है.
