Il metodo di dissoluzione appropriato è un fattore importante per il successo degli esperimenti sui peptidi. Una dissoluzione impropria causerà la perdita di peptidi e il fallimento dell'esperimento. Tuttavia, trovare il metodo di dissoluzione ideale a volte è piuttosto impegnativo. Di seguito le modalità di scioglimento proposte dai due gruppi tecnici di MOL Changes. metodo
MOL cambia la guida allo scioglimento del gruppo tecnologico
Il problema principale nella dissoluzione del peptide è la formazione della struttura secondaria.
Sebbene la formazione di strutture secondarie di catene peptidiche idrofobiche sia più evidente, ad eccezione delle catene peptidiche più corte, questo fenomeno si verifica in quasi tutte le catene peptidiche, indipendentemente dalla polarità. Perciò, il primo principio per sciogliere i polipeptidi è utilizzare acqua distillata sterile o acqua deionizzata (o acqua priva di ossigeno se le condizioni lo consentono).
La soluzione peptidica potrebbe subire una degradazione batterica. Per evitare questo fenomeno, il peptide deve essere sciolto in acqua distillata sterile, o filtrato con una membrana filtrante con una dimensione dei pori di 0.45 O 0.2 μm per la sterilizzazione. Polipeptidi contenenti Cys, Incontrato, e Trp sono particolarmente suscettibili all'ossidazione, quindi dovrebbero essere sciolti in acqua priva di ossigeno. L'acqua priva di ossigeno può essere ottenuta degasando a pressione ridotta iniettando gas inerti (azoto, elio, e argon).
Se il peptide è insolubile in acqua pura, il trattamento ad ultrasuoni può aiutare a rompere le particelle e aumentare la solubilità. Nota: Il trattamento ad ultrasuoni causerà il riscaldamento della soluzione e la degradazione del peptide.
Se il peptide contiene più aminoacidi basici, utilizzare una soluzione acquosa di acido acetico all'1~10%.; per peptidi molto idrofobici, utilizzo 50% acido acetico.
Se il polipeptide contiene una grande quantità di aminoacidi acidi, può essere sciolto in a 1 A 10% soluzione di ammoniaca o un tampone alcalino volatile come acetato o bicarbonato di etilmorfina. Il valore del pH deve essere regolato prima della cromatografia.
Se il peptide deve essere caricato sulla colonna, la quantità di solvente organico deve essere molto piccola, in caso contrario il tempo di conservazione sarà seriamente compromesso.
Se il polipeptide è altamente idrofobo perché contiene catene laterali di idrocarburi aromatici come Val, Leu, Incontrato, Fe, Tyr, Ala, ecc., o è un peptide neutro, l'uso di denaturanti di membrana come DMF o DMSO può aiutare a dissolvere il polipeptide:
UN. I denaturanti di membrana ad alta concentrazione aiutano a dissolvere il polipeptide distruggendone la struttura secondaria.
B. I denaturanti a membrana sono adatti per la preparazione di soluzioni per l'analisi dei peptidi, ma possono interferire con la ricerca sulla loro attività biologica.
C. Il DMF è il miglior denaturante (la concentrazione più alta può raggiungere 30%), e viene aggiunto goccia a goccia fino alla dissoluzione del peptide.
D. Durante la cromatografia in fase inversa, Il DMF uscirà insieme al picco anteriore dell'eluente. A seconda del volume di iniezione, il valore di picco può essere molto alto. La maggior parte dei peptidi può eluire entro pochi minuti dopo l'eluizione di una grande quantità di DMF. Se la catena peptidica è piccola ed eluisce troppo presto, la quantità del peptide sarà ridotta.
MOL Modifiche Guida allo scioglimento del Gruppo tecnico II
Come distinguere se gli aminoacidi sono neutri, acido o alcalino, e calcolare il metodo di dissoluzione:
1. Assegnare ciascun amminoacido acido nella sequenza polipeptidica incluso l'acido aspartico Asp (D), acido glutammico Glu (E) e carbossile-COOH C-terminale come -1; ciascun amminoacido basico compresa l'arginina Arg ( R), lisina Lys (K), istidina His (H) e all'ammino-NH2 N-terminale viene assegnato un valore di +1; gli amminoacidi neutri sono 0. Sulla base di questo, viene calcolato il valore dell'intero polipeptide, e il punteggio è positivo I peptidi con un punteggio negativo sono chiamati peptidi basici, quelli con un punteggio negativo sono chiamati peptidi acidi, e quelli con un punteggio pari a zero sono chiamati peptidi neutri.
2. Se è un peptide alcalino, prova prima a scioglierlo con acqua; se non può essere sciolto, provare a usare 10% – 30% acido acetico; se il peptide è ancora insolubile, provare a utilizzare acido acetico puro e acido trifluoroacetico TFA (<50 ml) per scioglierlo, e poi diluire la soluzione peptidica alla concentrazione desiderata.
3. Se è un peptide acido, prova prima a scioglierlo con acqua; se non può essere sciolto con acqua, provare a usare 13% acqua ammoniacale (v/v) per scioglierlo, e diluire la soluzione peptidica alla concentrazione richiesta. Se la sequenza peptidica contiene cisteina Cys (C), non può essere sciolto in soluzione alcalina. Prova i metodi seguenti.
4. I peptidi neutri vengono solitamente disciolti in solventi organici. Primo, prova ad usare l'acetonitrile (acetonitrile), o metanolo (metanolo) o isopropanolo (isopropanolo) dissolversi; per peptidi molto idrofobici, sciogliere prima con una piccola quantità di dimetilsolfossido (DMSO) e diluire con acqua alla concentrazione richiesta; se la sequenza peptidica contiene cisteina Cys (C), utilizzare dimetilformammide (DMF) o N-metilpirrolidone (NMP) per lo scioglimento. Per peptidi inclini all'aggregazione, aggiungere prima guanidina·HCl 6M o urea 8M (Urea) per scioglierli, e poi diluirli alla concentrazione richiesta.
illustrare:
1. Per facilitarne la conservazione ed il successivo utilizzo, si consiglia di sciogliere il peptide ad una concentrazione di circa 1-2 mg/ml.
2. La normale polvere liofilizzata del peptide può essere conservata a -20°C per più di un anno. Per peptidi disciolti, si consiglia di aliquotare e conservare a -20°C; se la sequenza peptidica contiene metionina Met (M), acido cisteina cis (C) o tirosina Tyr (Y) si consiglia di conservare in un ambiente privo di ossigeno per prevenire l'ossidazione.
Elenco degli aminoacidi allegato:
1.Aminoacidi neutri: glicina, alanina, leucina, isoleucina, valina, cisteina, metionina, treonina, serina, fenilalanina, tirosina, acido triptofano, prolina, asparagina e glutammina
Fmangia: Questo tipo di molecola di amminoacido contiene solo un gruppo amminico e un gruppo carbossilico
2.Amminoacidi acidi: acido glutammico, acido aspartico
Caratteristiche: Questo tipo di molecola di amminoacido contiene un gruppo amminico e due gruppi carbossilici
3.Amminoacidi basici: lisina, arginina, istidina
Caratteristiche: Questo tipo di amminoacido contiene un gruppo diamminocarbossilico nella sua molecola; l'istidina ha un anello di azoto ed è debolmente alcalina, ed è anche un amminoacido basico.
