Proteomhärledda peptidbibliotek för djup specificitetsprofilering av N-terminala modifieringsreagens

Protein- och peptid N-termini är viktiga mål för selektiv modifiering med kemoproteomikreagenser och biokonjugeringsverktyg. Den N-terminala a-aminen förekommer endast en gång i varje polypeptidkedja, vilket gör det till ett attraktivt mål för proteinbiokonjugering. I celler, nya N-terminaler kan genereras genom proteolytisk klyvning och fångas upp av N-terminala modifieringsreagenser som möjliggör proteomomfattande identifiering av proteassubstrat med tandemmasspektrometri (LC-MS/MS). En förståelse av den N-terminala sekvensspecificiteten för modifieringsreagensen är kritisk för var och en av dessa tillämpningar. Proteomhärledda peptidbibliotek i kombination med LC-MS/MS är kraftfulla verktyg för att profilera sekvensspecificiteten hos N-terminala modifieringsreagenser. Dessa bibliotek är mycket olika, och LC-MS/MS möjliggör analys av modifieringseffektiviteten för tiotusentals sekvenser i ett enda experiment. Proteomhärledda peptidbibliotek är ett kraftfullt verktyg för att profilera sekvensspecificiteterna hos enzymatiska och kemiska peptidmärkningsreagenser. Subtiligas och 2-pyridinkarboxaldehyd (2PCA) är två reagens som har utvecklats för selektiv N-terminal peptidmodifiering och som kan studeras med hjälp av proteomhärledda peptidbibliotek. Detta protokoll beskriver stegen för att generera N-terminalt olika proteomhärledda peptidbibliotek och för att tillämpa dessa bibliotek för att profilera specificiteten hos N-terminala modifieringsreagenser. Vi detaljerar stegen för att profilera specificiteten för 2-pyridinkarboxaldehyd, ett kemiskt modifieringsreagens, och subtiligas, ett enzymatisk modifieringsreagens. Dessa protokoll kan lätt anpassas till alternativa proteomkällor och andra N-terminala peptidmärkningsreagenser.