पेप्टाइड संश्लेषण दिशा - असेंबली से अलग एन-टू-सी अनुक्रम रीडिंग
घर पेप्टाइड्स और प्रोटीन एक प्रयोगशाला को पहले लाइसिन सूचीबद्ध करने वाला एक संश्लेषण रिकॉर्ड प्राप्त होता है, जबकि ऑर्डर किया गया पेप्टाइड ग्लाइसिन से शुरू होता है. वह स्पष्ट विरोधाभास पूरी तरह से सामान्य हो सकता है. पेप्टाइड अनुक्रम पारंपरिक रूप से एन टर्मिनस से सी टर्मिनस तक लिखे जाते हैं, लेकिन पारंपरिक ठोस-चरण पेप्टाइड संश्लेषण आमतौर पर श्रृंखला को विपरीत अवशेष क्रम में जोड़ता है. लिखित आदेश को असेंबली आदेश के साथ भ्रमित करने से समीक्षक सही लक्ष्य को उलट सकता है.
इसलिए खोज वाक्यांश "पेप्टाइड संश्लेषण एन से सी टर्मिनस" को मार्ग-विशिष्ट उत्तर की आवश्यकता है. राइबोसोमल अनुवाद इसके सी-टर्मिनल सिरे पर एक श्रृंखला को लंबा कर देता है, एन-टू-सी वृद्धि दे रहा है. पारंपरिक एसपीपीएस आम तौर पर एक समर्थन से जुड़े सी-टर्मिनल अवशेष से शुरू होता है और अवशेषों को एन टर्मिनस की ओर जोड़ता है. विशिष्ट रासायनिक रणनीतियाँ मौजूद हैं, इसलिए रूट रिकॉर्ड सभी संश्लेषण के बारे में एक पूर्ण नियम से अधिक मायने रखता है.
इस गाइड का उद्देश्य एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैंडओवर है. एक अन्य प्रयोगशाला को इच्छित अणु का पुनर्निर्माण करने में सक्षम होना चाहिए, असेंबली रिकॉर्ड को समझें, और अवशेष क्रम के साक्ष्य को उन साक्ष्यों से अलग करें जो केवल संरचना का समर्थन करते हैं.
उन मार्गों की तुलना करें जहां नए बांड बनाए जाते हैं
पारंपरिक एसपीपीएस में, बढ़ती श्रृंखला को एक ठोस समर्थन पर बनाए रखा जाता है जबकि क्रमिक डीप्रोटेक्शन और कपलिंग ऑपरेशन इसके एन-टर्मिनल सिरे को उजागर और विस्तारित करते हैं. मूल मेरिफ़िल्ड अध्ययन ने एक विशिष्ट टेट्रापेप्टाइड उदाहरण में ठोस-चरण असेंबली की स्थापना की. आधुनिक कार्यान्वयन कई सुरक्षा जोड़ते हैं, लिंकर, और उपकरण विकल्प, लेकिन वे अंतिम अनुक्रम लिखने की परंपरा को नहीं बदलते हैं.
राइबोसोमल अनुवाद में, अनुवादित कोडिंग अनुक्रम के अनुसार अमीनो एसिड शामिल किए जाते हैं, और नवजात श्रृंखला N से C तक बढ़ती है. निसेन और सहकर्मियों द्वारा किया गया संरचनात्मक कार्य राइबोसोमल पेप्टाइड-बॉन्ड-गठन केंद्र के बारे में प्राथमिक साक्ष्य प्रदान करता है. दिशा भेद के लिए उस पेपर से प्रत्येक ऐतिहासिक यंत्रवत व्याख्या को अपनाने की आवश्यकता नहीं है.
| मार्ग | असेंबली तर्क | हैंडओवर के लिए आवश्यक जानकारी | महत्वपूर्ण सीमा |
|---|---|---|---|
| पारंपरिक एसपीपीएस | सी-टर्मिनल अवशेष समर्थन-बाध्य है; श्रृंखला विस्तार एन टर्मिनस की ओर बढ़ता है | अंतिम एन-टू-सी अनुक्रम, पहचान लोड हो रही है, संरक्षण योजना, लिंकर, और दरार परिणाम | असेंबली आदेश अनुक्रम आदेश को फिर से परिभाषित नहीं करता है; अंतिम टर्मिनी मार्ग पर निर्भर करती है |
| राइबोसोमल अभिव्यक्ति | अनुवादित श्रृंखला N से C तक बढ़ती है | निर्माण, अनुवादित अग्रदूत, प्रसंस्करण चरण, और परिपक्व उत्पाद विशिष्टता | व्यक्त अग्रदूत स्वचालित रूप से पृथक परिपक्व पेप्टाइड नहीं है |
| समाधान-चरण रासायनिक युग्मन | संरक्षित अवशेषों या टुकड़ों को चयनित मार्ग के अनुसार जोड़ा जाता है | खंडित पहचान, प्रतिक्रियाशील समाप्त होता है, युग्मन क्रम, और सुरक्षा इतिहास | कोई भी एकल आशुलिपि दिशा प्रत्येक अभिसरण खंड योजना का वर्णन नहीं करती है |
| देशी रासायनिक बंधाव | एक उपयुक्त पेप्टाइड थायोस्टर और एक एन-टर्मिनल सिस्टीन टुकड़ा एक निर्दिष्ट जंक्शन पर जुड़े हुए हैं | खंडित सीमाएँ, जंक्शन रसायन शास्त्र, और कोई भी आगामी परिवर्तन | सफल बंधाव स्वतंत्र रूप से अंतिम तह या प्रत्येक संरचनात्मक सुविधा को स्थापित नहीं करता है |
डॉसन और सहकर्मियों का मूल रासायनिक बंधाव अध्ययन एक अलग मार्ग अवधारणा प्रदान करता है: मूल निवासी बनाने के लिए उचित रूप से प्रतिक्रियाशील टुकड़े जुड़ जाते हैं डाउनलोड करना पेप्टाइड बंधन. इसके टुकड़े की आवश्यकताओं को एसपीपीएस के समान एक-अवशेष जोड़ आरेख में संपीड़ित नहीं किया जाना चाहिए. एक अंतिम श्रृंखला में अभी भी एन-टू-सी ऑर्डर होता है, भले ही कई टुकड़े और बाद के ऑपरेशन इसे उत्पन्न करते हों.
एक शिक्षण परियोजना: लक्ष्य को उलटे बिना आदेश का समाधान करें
काल्पनिक शिक्षण परियोजना. लक्ष्य रैखिक H-Leu-Ala-Phe-Thr-OH है, H-LAFT-OH लिखा है, इच्छित एल कॉन्फ़िगरेशन के साथ, मुफ़्त टर्मिनी और कोई अतिरिक्त संशोधन नहीं. किसी मार्ग के चयन से पहले लक्ष्य क्रम तय किया जाता है. कोई उपज नहीं, इस नियोजन अभ्यास में शुद्धता या सफल संश्लेषण की कल्पना की जाती है.
पारंपरिक एसपीपीएस में, थ्र4 चयनित समर्थन/लिंकर के माध्यम से जुड़ा हुआ सी-टर्मिनल अवशेष है. Phe3, Ala2 और Leu1 को बाद में N टर्मिनस की ओर पेश किया गया. The अमेरिकन पेप्टाइड सोसायटी एसपीपीएस प्राइमर सामान्य सभा अवधारणा की व्याख्या करता है, लेकिन इसका काम किया हुआ रिंक-एमाइड उदाहरण इस फ्री-एसिड लक्ष्य के लिए समर्थन को परिभाषित नहीं करता है. अंतिम अंतिम समूह की योजना अलग से बनाई जानी चाहिए.
परिचालन सूची थ्र, पीएचई, अला, इसलिए ल्यू एलएएफटी के साथ संगत है. अंतिम-उत्पाद लेबल टीएफएएल एक अलग अवशेष क्रम का वर्णन करता है. उत्क्रमण त्रुटि घोषित करने से पहले, पहचानें कि सूची में वांछित उत्पाद दर्ज है या नहीं, लोडिंग का समर्थन करें, या बाद की अतिरिक्त घटनाएँ. एक संश्लेषण इंटरफ़ेस अंतिम एन-टू-सी लक्ष्य को स्वीकार कर सकता है और आंतरिक रूप से परिचालन आदेश उत्पन्न कर सकता है; उस इनपुट को उलटने से स्वयं एक त्रुटि उत्पन्न हो जाएगी. अक्सर पूछे जाने वाले प्रश्न
प्रत्येक सफल वैचारिक कदम के बाद समर्थन-बद्ध श्रृंखला का पालन करें: टी, फिर एफ.टी, फिर एएफटी, फिर LAFT. N को C लिखा गया, प्रत्येक नया अवशेष मौजूदा श्रृंखला के बाईं ओर दिखाई देता है. यह अनुरेखण अभ्यास यह याद रखने से अधिक विश्वसनीय है कि संश्लेषण "पीछे की ओर" है,"क्योंकि यह दर्शाता है कि कौन सा आणविक अंत बदलता है और लक्ष्य अवशेषों की संख्या को बरकरार रखता है.
यह एक काल्पनिक लॉग विसंगति का भी स्थानीयकरण करता है. यदि Ala2 जोड़ घटना अनुपस्थित है, बाद में एफटी में ल्यू को शामिल करना उस सरलीकृत इतिहास के तहत एलएफटी विलोपन उम्मीदवार के अनुरूप होगा. यदि सभी चार अवशेष मौजूद हैं लेकिन अंतिम रिकॉर्ड टीएफएएल कहता है, मुद्दा गायब अवशेष के बजाय ऑर्डर या लेबलिंग से संबंधित है. ये जांच के लिए उम्मीदवार हैं, अकेले लॉग से निदान नहीं होता: अपूर्ण प्रतिक्रियाएँ और अलिखित पुनर्कार्य अन्य प्रजातियाँ उत्पन्न कर सकते हैं.
जब उनके टर्मिनल फॉर्म मेल खाते हैं तो एलएएफटी और टीएफएएल में समान अवशेष संरचना और समान सैद्धांतिक अक्षुण्ण द्रव्यमान होता है. अपेक्षित द्रव्यमान कुछ विलोपन का पता लगाने में मदद कर सकता है, लेकिन यह इस उलटफेर को सुलझा नहीं सकता. ऑर्डर विवाद के लिए अनुक्रम-संवेदनशील साक्ष्य और फ्री-एसिड-बनाम-एमाइड विवाद के लिए टर्मिनल-समूह साक्ष्य चुनें; एक सामान्य पहचान चेकबॉक्स अंतर छुपाता है.
सरलीकृत लापता-अला उम्मीदवार एलएफटी के लिए, अपेक्षित तटस्थ द्रव्यमान एक एलानिन अवशेष योगदान द्वारा एलएएफटी से कम है, मुक्त अमीनो एसिड द्रव्यमान द्वारा नहीं. विलोपन से अवशेष सूची और संख्या दोनों बदल जाती है बी टाइप पेप्टाइड रीढ़ की हड्डी के बंधन; अवशेष लेखांकन में वह अंतर पहले से ही शामिल है. संबंधित द्रव्यमान का शिखर विलोपन की जांच को उचित ठहराएगा, लेकिन अन्य असाइनमेंट और आयन फॉर्म को नामकरण से पहले अभी भी बहिष्करण की आवश्यकता है.
इसलिए एक रूट आरेख दो अलग-अलग समीक्षा प्रश्न उत्पन्न कर सकता है. एक संदिग्ध उत्क्रमण पूछता है कि क्या वही अवशेष गलत क्रम में होते हैं; एक संदिग्ध विलोपन पूछता है कि क्या एक अवशेष अनुपस्थित है. पहला अक्षुण्ण द्रव्यमान को संरक्षित कर सकता है, जबकि दूसरा रचना बदलता है. अतिरिक्त विश्लेषण का अनुरोध करने से पहले उस अंतर को बताने से जांच केवल दूसरा प्रमाणपत्र मांगने की तुलना में अधिक विशिष्ट हो जाती है. पेप्टाइड सिंथेसिस कंपनी
एक पुनः संयोजक मार्ग के लिए एक अनुवादित अग्रदूत और वांछित परिपक्व ट्रिपेप्टाइड प्राप्त करने के उपयुक्त साधन की आवश्यकता होगी. इस काल्पनिक छोटे शिक्षण लक्ष्य के लिए, पारंपरिक एसपीपीएस एक सीधा नियोजन ढांचा प्रदान करता है क्योंकि अनुरोधित अंतिम समूहों को सीधे निर्दिष्ट किया जा सकता है. यह एक तर्कसंगत परियोजना विकल्प है, यह कोई सार्वभौमिक दावा नहीं है कि हर छोटा पेप्टाइड रासायनिक रूप से आसान या सस्ता होता है.
यदि प्रोजेक्ट लंबे मुड़े हुए प्रोटीन खंड में बदल जाता है, मार्ग तुलना बदल जाती है. अभिव्यक्ति, खंड बंधाव, या कोई अन्य रासायनिक रणनीति आकर्षक बन सकती है. केवल लंबाई से ही निर्णय नहीं हो जाता; संशोधनों, तह, वसूली, और अंतिम उत्पाद के लिए साक्ष्य भी मायने रखते हैं.
लक्ष्य से पृथक नमूने तक न्यूनतम रिकॉर्ड सुरक्षित रखें
अनुक्रम आरेख संपूर्ण विनिर्माण हैंडओवर नहीं है. लक्ष्य विनिर्देश को असेंबली निर्देशों से अलग रखें, और दोनों को पृथक नमूने से जोड़कर रखें. यह प्रक्रिया शॉर्टहैंड को उत्पाद विवरण समझने की भूल से बचाता है.
| न्यूनतम रिकॉर्ड | आवश्यक विवरण | गायब होने पर क्या निष्कर्ष नहीं निकाला जा सकता |
|---|---|---|
| अंतिम लक्ष्य | एन-टू-सी अनुक्रम, अवशेष विन्यास, टर्मिनी, संशोधनों, और संबंध | वह दो रूट आउटपुट एक ही अणु का वर्णन करते हैं |
| मार्ग मानचित्र | लोडिंग या अग्रदूत पहचान का समर्थन करें, खंडित सीमाएँ, और परिचालन आदेश | क्या स्पष्ट अनुक्रम उलटाव एक सच्ची त्रुटि है |
| प्रसंस्करण इतिहास | संरक्षण, दरार, टैग हटाना, बंधाव, और अन्य प्रासंगिक परिवर्तन | पृथक उत्पाद में इच्छित टर्मिनल समूह हैं |
| शुद्धिकरण रिकार्ड | भिन्न, पूलिंग निर्णय, विधि की शर्तें, और अंतिम नमूना मानचित्रण | विश्लेषण किया गया अंश वितरित शीशी का प्रतिनिधित्व करता है |
| विश्लेषणात्मक पैकेज | पहचान प्रमाण, क्रोमैटोग्राफिक विधि, कच्चा डेटा, और सीमाएँ | अनुक्रम, विन्यास, और एक द्रव्यमान मूल्य से पूर्ण शुद्धता |
| मात्रा एवं उपयोग | राशि का आधार, नमूना स्थिति, इच्छित प्रयोग, और स्वीकृत स्वीकृति मानदंड | वह समान सकल भार समान मात्रा में लक्ष्य प्रदान करता है |
अभिव्यक्ति के लिए, वास्तविक परिपक्व एन शामिल करें- और प्रसंस्करण के बाद सी-टर्मिनल सीमाएँ. एक फ़्यूज़न टैग उत्पादन में सहायता कर सकता है लेकिन यदि प्रसंस्करण योजना अधूरी है तो अवांछित अवशेष या अशुद्ध आबादी छोड़ सकता है. एसपीपीएस के लिए, केवल अनुक्रम अक्षरों से मुक्त एसिड या एमाइड का अनुमान लगाने के बजाय इच्छित दरार उत्पाद का दस्तावेजीकरण करें.
खंडित मार्गों के लिए, प्रत्येक इनपुट टुकड़े की पहचान और उसके जुड़ने की जगह के साक्ष्य को बनाए रखें. घटकों के योग के अनुरूप अंतिम द्रव्यमान यह स्थापित नहीं करता है कि प्रत्येक बंधन इच्छित स्थान पर बनाया गया था. संरचनात्मक प्रश्न को विश्लेषणात्मक प्रश्न निर्धारित करना चाहिए.
एक निश्चित क्रम में विसंगतियों की समीक्षा करें
सबसे पहले अंतिम विनिर्देश को एन-टू-सी क्रम में ज़ोर से पढ़ें. दूसरा यह पहचानें कि क्या प्रत्येक प्रक्रिया सूची लक्ष्य क्रम का वर्णन करती है, अतिरिक्त आदेश, या खंड क्रम. तीसरा प्रत्येक ऑपरेशन को संबंधित आणविक अंत तक मैप करें. चौथा, अपेक्षित संसाधित उत्पाद की तुलना पृथक नमूने के विश्लेषणात्मक साक्ष्य से करें.
दोनों समन्वय प्रणालियों को रिकॉर्ड में सुरक्षित रखें: अतिरिक्त घटना तीन अंतिम श्रृंखला के शेष दो के अनुरूप हो सकती है, यह इस पर निर्भर करता है कि समर्थन लोडिंग को एक घटना के रूप में गिना जाता है या नहीं. वह गणना नियम बताइये. स्वचालित रिपोर्टें जो केवल संख्यात्मक संचालन करती हैं 1, 2, 3 और 4 अन्यथा गलत अवशेष को एक नमूना या विफल युग्मन निर्दिष्ट कर सकता है. विश्लेषणात्मक असाइनमेंट के लिए अंतिम लक्ष्य निर्देशांक का उपयोग करें और प्रक्रिया जांच के लिए ऑपरेशन नंबर बनाए रखें.
यदि एकमात्र गायब जानकारी अतिरिक्त सूची पर लेबल है, पुनर्संश्लेषण का प्रस्ताव करने से पहले उस स्पष्टीकरण का अनुरोध करें. यदि वास्तविक टर्मिनल रसायन विज्ञान अनिर्दिष्ट है, अवशेष क्रम स्पष्ट होने पर भी उत्पाद की पहचान अधूरी रहती है. यदि कोई संदिग्ध द्रव्यमान कई अनुक्रम आइसोमर्स से मेल खाता है, एक ऐसी विधि की ओर बढ़ें जो विशिष्ट अस्पष्टता को संबोधित कर सके.
सामान्य विफलताओं में रिवर्स एडिशन सूची को ऑर्डर फॉर्म में कॉपी करना शामिल है, एक पूर्ववर्ती अनुक्रम को एक परिपक्व उत्पाद के रूप में मानना, और यह मानते हुए कि उच्च क्रोमैटोग्राफ़िक क्षेत्र प्रतिशत सही अवशेष क्रम साबित करता है. ये रसायन विज्ञान की समस्याओं के समान ही रिकॉर्ड और व्याख्या की समस्याएं हैं.
मार्ग स्थानांतरण के लिए, अप्रत्यक्ष पठन सूची संलग्न करने के बजाय एक ठोस विसंगति पर टिप्पणी करें. “लॉग सी से एन तक अतिरिक्त चीजों को सूचीबद्ध करता है, जबकि ऑर्डर फॉर्म अंतिम श्रृंखला एन से सी तक सूचीबद्ध करता है" एक नोटेशन समस्या का समाधान करता है. "लिंकर रिलीज़ रसायन विज्ञान प्रलेखित नहीं है" एक अनसुलझे टर्मिनल-पहचान मुद्दे की पहचान करता है. कोई भी कथन यह स्थापित नहीं करता कि एक पृथक शीशी में वास्तव में क्या है.
अक्सर पूछे जाने वाले प्रश्नों
क्या पेप्टाइड संश्लेषण सदैव N से C की ओर बढ़ता है?? नहीं. राइबोसोमल अनुवाद करता है, जबकि पारंपरिक एसपीपीएस आमतौर पर सी-टर्मिनल अवशेष से एन टर्मिनस की ओर असेंबल होता है. रासायनिक टुकड़े की रणनीतियों को अपने स्वयं के मार्ग विवरण की आवश्यकता होती है.
क्या मुझे पारंपरिक एसपीपीएस ऑर्डर करते समय अनुक्रम को उलट देना चाहिए?? नहीं. सहमत एन-टू-सी सम्मेलन में अंतिम अनुक्रम सबमिट करें. संश्लेषण टीम उस लक्ष्य को एक परिचालन संयोजन योजना में परिवर्तित करती है.
क्या मास स्पेक्ट्रोमेट्री यह साबित कर सकती है कि क्रम सही है? एक अक्षुण्ण द्रव्यमान अकेले समान संरचना वाले अनुक्रम आइसोमर्स को अलग नहीं कर सकता है. उपयुक्त अनुक्रम-संवेदनशील माप अतिरिक्त साक्ष्य प्रदान कर सकते हैं, लक्ष्य और विधि के आधार पर.
किसी अन्य प्रयोगशाला को पहले क्या प्राप्त करना चाहिए?? एक पूर्ण अंतिम लक्ष्य विनिर्देश और एक स्पष्ट रूप से लेबल किया गया मार्ग मानचित्र. ये विश्लेषणात्मक परिणामों की व्याख्या करने से पहले इच्छित अणु और प्रक्रिया रिकॉर्ड के अर्थ को स्थापित करते हैं.
