Брз одговор
Прилагодените тешки пептиди можат да поддржат квантитативна масена спектрометрија само кога лабораторијата знае кој означен вид бил доставен, како е доделен нејзиниот износ…
Прилагодени тешки пептиди - пет заблуди за верификацијата на изотоп
Заблуда една: Чистотата на HPLC ја воспоставува чистотата на изотопот
Прилагодените тешки пептиди можат да поддржат квантитативна масена спектрометрија само кога лабораторијата знае кој означен вид бил доставен, како е доделен нејзиниот износ, и кои чекори на мерење е наменет да ги контролира. Зборот „тежок“ не го дефинира целосниот внатрешен стандард, и еден процент на чистота не може да одговори на сите тие прашања.
Хипотетички проект: лабораторија нарачува H-AGSVQTK-OH како внатрешен стандард за истражување, со C-терминал Lys7 кој содржи шест атоми јаглерод-13 и два азот-15. Термините и другите структурни карактеристики се совпаѓаат со предвидената светлина. Нема аналитички перформанси, точност на концентрацијата, или се претпоставува отсуство на светлосна контаминација.
Првиот погрешен заклучок е дека резултатот со висока чистота на површината на HPLC докажува висок процент од предвидените видови означени со изотоп. Хроматографската чистота го опишува интегрираниот одговор на методот. Информациите поврзани со изотопи се однесуваат на дистрибуцијата на изотопските состави и дефиницијата на пријавената вредност на збогатување или чистота.
Поправениот заклучок е да се побараат двата вида докази со експлицитни дефиниции. Прашајте дали изјавата за изотоп се однесува на збогатување на атом во градежен блок, конечната означена молекуларна популација, или друга мерка. Овие описи не треба да се третираат како заменливи без разбирање на задачата.
Потребните докази ги вклучуваат релевантните масовно-спектрални информации на конечната лота, предвидената изотопска шема, и објаснување за пријавената вредност на изотоп. Исто така, треба да се однесува на кој било лесен или делумно означен вид релевантен за анализата. Лабораторијата не треба да го заклучи нивното отсуство само затоа што главниот хроматографски врв е голем.
Заблуда два: поимот тежок ја дефинира позицијата на етикетата
Втората грешка е да се нарача позната низа како „тешка“ и да се претпостави дека секој добавувач ќе ги постави истите изотопи на истото место. Спецификацијата треба да го идентификува означениот остаток, видовите и бројот на изотопи, и сите други модификации. Етикетата на различна позиција може да промени кои фрагменти ја носат разликата во масата.
Во AGSVQTK, експлицитно идентификувајте ги Lys7 и неговите шест замени со јаглерод-13 и две азот-15. На официјална ProForma стандардна страница ја наведува конечната верзија 2.1; потврдете ја ознаката што ја поддржува системот за примање. Зачувајте ја спецификацијата за изотоп читлив за човек, така што стенографската етикета не може тивко да го редефинира стандардот.
Олигопептиди 2 На Unimod 13C6/15N2 рекорд дава моноизотопско зголемување на 8.014199 Да за таа замена. Инкрементот припаѓа на дефиниран состав, наместо секој производ наречен „Lys8“ или „плус осум“. Тоа е неутрална разлика; јонската споредба дополнително бара полнење и задржување на етикетата.
Потребниот доказ е молекуларна спецификација поврзана со вистинската група и аналитички задачи во согласност со неа. Корисно е името на категоријата стандардна етикета, но не ја утврдува структурата или дистрибуцијата на изотопот на испорачана вијала сама по себе.
Две номинални плус осум етикети. Unimod одделно наведува Лизин 2H8 со ан 8.050214 Моноизотопско зголемување. Тој заменува осум водороди со деутериум наместо да замени шест јаглерод и два азот. Двата зголемувања заокружуваат до осум со целобројна прецизност, но точните состави се разликуваат.
Користење на снимените вредности, разликата помеѓу двата зголемувања е 8.050214 − 8.014199 = 0.036015 И. Во исто двојно протонирана состојба на полнење, нивното пресметано раздвојување маса до полнење би било 0.0180075. Оваа аритметика не тврди дека вистински метод го решава видот, дека или етикетата е присутна во испорачаната група или дека нивната хроматографија е идентична. Покажува зошто името на етикетата со цел број е недоволно за точно доделување.
Елементарниот идентитет и изотопскиот состав опишуваат различни нивоа на целта. Замената на јаглерод-12 со јаглерод-13 го зачувува елементот јаглерод додека ја менува масата специфична за изотопот. Молекуларната формула која ги запишува само збирките на обичните елементи може да ја испушти разликата што го дефинира стандардот. Задржете опис решен со изотоп наместо да се потпирате на неозначената формула и прекар.
Кога испорачаната етикета се разликува од барањето, разликуваат корекција на документација од физичка замена. Ако само сертификатот користи двосмислена стенографија, дополнителните записи може да го разјаснат материјалот што е веќе присутен. Ако вистинската шема на изотоп се разликува, менувањето на описот не го прави првично наведениот стандард. Лабораторијата мора да ги процени претпоставките за различниот материјал и кој било зависен метод пред да одлучи дали може да ја исполни предвидената улога.
D во неформалното име на изотоп „D8“ се однесува на деутериум. D-Lys во стереохемиски опис се однесува на различен концепт на конфигурација. Изотопско означување Олигопептиди 24 и L/D конфигурацијата се независни делови од целта. Снимете ги и двете кога е релевантно, наместо да преведувате една кратенка што содржи D во друга.
Дозирање на окситоцин пептид Потврдете ги и терминалните групи, конфигурација каде што е релевантно, и сите дополнителни модификации. Усогласувањето на шемата на изотоп додека се менува основната молекуларна форма не создава соодветно усогласен светло/тежок пар за предвидената споредба.
Заблуда три: промената на масата на претходникот го потврдува секој избор на производ-јонски
Трета грешка е да се најде очекуваната претходничка разлика и да се претпостави дека секој производен јон е подеднакво корисен за разликување на тешки и лесни материјали. Локацијата на етикетата на изотоп е важна бидејќи фрагментот може да го содржи означениот остаток или да го исклучи. Олигопептиди 41
За хипотетичката C-терминална ознака на лизин, конвенционален фрагмент од секвенца што го исклучува Lys7 не го добива масовниот придонес на етикетата само затоа што неговиот претходник бил тежок. Фрагмент кој ја содржи дефинираната ознака го носи релевантниот придонес, со забележаната m/z разлика и во зависност од јонскиот полнеж.
Ова е очекување засновано на состав, не е замена за толкување на стекнат спектар. Доделување фрагмент, неутрални загуби, мешање, и однесувањето на инструментот мора да се оцени во вистинскиот метод. Не претворајте едноставно правило за низа во непроверена листа на сигурни транзиции.
Потврдете ги вистинските доделби на претходници и производ-јони во однос на целосниот состав и локација на изотоп. Преминот увезен од друг стандард „плус-осум“ може да шифрира различна ознака или молекуларна форма. Зачувајте ја пресметката и спецификацијата на изворот со методот на анализа наместо да се претпостави дека совпаѓачкото поместување на цел број воспоставува еквивалентност.
Потребните докази вклучуваат соодветна светлина само, само тешки, и набљудувања или контроли поврзани со матрицата за прашањето на методот. Врв на очекувано m/z не е автоматски ослободен од пречки, а етикетата не го прави секој измерен сигнал уникатно да се припише на целта.
Заблуда четири: мерењето на тешкиот прав ја утврдува неговата доделена количина
Четврта грешка е да се третира номиналната маса на вијалата како количина на наменетата означена цел. Бруто материјалот може да вклучува и други компоненти освен таа цел, а популацијата на изотоп може да бара сопствено толкување. Доделувањето количество и карактеризацијата на изотоп се поврзани, но различни задачи.
Службеникот Страница за услугата HeavyPeptide AQUA ги разликува нивоата на услуги и доставените формати. Потврдете ја вистинската квантитативна испорака за вратената нарачка. Категоријата на услуги не утврдува дека секоја презентација вклучува идентичен износ.
Поправениот заклучок е да се побара јасна дефиниција за количина или концентрација, основа на задача, и релевантни ограничувања за испорачаната парцела и Цврст пептид презентација. Ако вредноста се однесува на вкупниот материјал поврзан со пептидите, прашајте како се поврзува со планираните видови означени со изотоп што се користат во пресметката.
Не применувајте тивко процент на хемиска чистота и процент на изотоп како независни множители без да разберете како е изведено доделеното количество. Нивните дефиниции може да се преклопуваат или да опишуваат некомпатибилни основи. Прецизен резултат сè уште може да се заснова на невалидна пресметка.
Чувајте го именителот за доделениот износ експлицитен. Тоа може да се однесува на сите синџири поврзани со пептиди, целната низа низ изотопските форми, или наменетите означени молекуларни видови. Тие количини не мора да се совпаѓаат. Задачата веќе корегирана на наменетиот вид не треба повторно да ја добие истата корекција само затоа што друг процент се појавува на сертификатот.
Подготовка на рекорд, трансфери, контејнери, и релевантна историја на холдинг. Оправдана доделена сума при приемот не гарантира дека истата сума достигнува секое подоцнежно мерење. Ракувањето со внатрешниот стандард треба да остане поврзано со неговата аналитичка улога. Пептид Дерморфин
Промената во спецификацијата на изотопот треба да предизвика преглед на зависните пресметки и записи во методот. Чувајте ги старите и ревидираните записи за целите одделно да се идентификуваат. Ажурирањето на прекарот на шишенцето без проверка на масите и транзициите може да направи правилно измерениот сигнал да изгледа дека недостасува или е поместен, додека неправилно широк прозорец за екстракција може да ја прикрие неусогласеноста.
Заблуда пет: тежок пептид додаден по варењето го контролира целиот работен тек
Петтата грешка е да се претпостави дека внатрешниот стандард компензира за чекорите што се случиле пред да биде воведен. Слободен пептид додаден по дигестијата на протеините не може директно да пријави колку од целниот протеин е изгубен или колку ефикасно неговиот целен пептид бил генериран за време на претходната обработка.
Поправениот заклучок е да се дефинира опсегот на контролата. Соодветниот тежок пептид може да помогне да се проценат фазите на мерење што соодветно ги придружува, но автоматски не го потврдува целиот работен тек од протеин до резултат.
Контрапример за премногу широко отфрлање: ако наведеното прашање е одговор на веќе подготвен пептиден примерок во низводното мерење LC-MS, за таа ограничена цел може да биде соодветен пептиден стандард по дигестија. Не треба да се отфрли само затоа што не го следи варењето; барањето мора да одговара на точката на додавање.
| Експериментална цел | Избор на модификација | Контроли или евиденција | Читање и ограничување |
|---|---|---|---|
| Разликувајте тешка и лесна цел | Дефинирани типови на изотопи, брои, и сајт | Само лесни и само тешки докази релевантни за методот | Доделено однесување на претходник и фрагмент; нема претпоставена универзална специфичност |
| Користете познат внатрешен стандарден износ | Карактеризирана означена цел со основа на наведена сума | Записи за доделување и подготовка на многу | Пресметка заснована на сооднос во рамките на поддржаниот модел на количини |
| Следете го мерењето низводно | Соодветен соодветен пептиден стандард | Точка на собирање и релевантни матрични контроли | Изведба за придружните фази, не се забележани претходни загуби |
Прегледајте го стандардот како целосно специфицирана молекула: видови на изотопи, брои, сајт, основната структура и доделената количина. Поврзете ја таа дефиниција со вистинскиот дел и метод. Номиналната ознака останува погодно име само откако тие полиња се зачувани.
Најчесто поставувани прашања
Дали хемиската чистота и чистотата на изотопот се исти атрибути? бр. Тие опишуваат различни аспекти на подготовката и имаат потреба од експлицитни дефиниции. Високиот процент на хроматографска површина не ја утврдува планираната популација на изотопи.
Дали ознаката плус осум го поместува секој јон за осум m/z единици? бр. Точниот состав на изотоп, дали јонот ја содржи ознаката, и полнењето на јоните е се'. Користете ја соодветната пресметка на масата и вистинските спектрални докази.
Може ли да се заклучи количината на тежок пептид од неговата маса на вијалата? Не автоматски. Добијте ја дефиницијата на количината и основата за доделување, потоа конзистентно се земат предвид наведениот материјал и популација на изотопи.
Дали додавањето на слободниот тежок пептид пред варењето нужно го решава проблемот со целиот процес? бр. Слободниот пептид не се однесува автоматски како недопрениот протеин за време на екстракција и протеолиза. Изберете контроли што се однесуваат на вистинското прашање нагоре.
