Seo ehlileng e Lokelang ho se Etsoa ke Setsi sa Ts'enyeho-Screening
Pele o hlahloba QC, e thusa ho arola lihlopha tsa reagent tse amehang. Litaelo tse tloaelehileng tsa proteomic le lik'hemik'hale tsa lipatlisiso li khetholla baqolotsi ba litaba ka fluorescent, li-probe tse thehiloeng ho ts'ebetso, le li-reagents tse matlafatsang kamano, e 'ngoe le e' ngoe e fetolang tsamaiso ea ubiquitin-proteasome (UPS) ts'ebetso ho etsa palo e lekanyang liseleng, lysates, kapa maikutlo a se nang lisele.
-
Li-labels tsa fluorescent etsa hore u bone ka mahlo a kelello kapa u lekanye li-enzyme tse sebetsang, li-subunits tsa proteasome, kapa li-substrates tsa moqolotsi ka in-gel fluorescence, microscope, kapa ho fumana/tahlehelo ya baqolotsi ba ditaba.
-
Litlaleho tsa Biotin ke lisebelisoa tsa ho ntlafatsa, ho ts'oara li-deubiquitinase tse sebetsang (DUBs) kapa liprotheine tse fetotsoeng ka streptavidin hula fatše pele ho immunoblotting kapa mass-spectrometry identification.
-
Ubiquitin le NEDD8-mimetic probes le li-substrates tsa fluorogenic kapa FRET li hlahloba li-enzyme le li-ligase tse lokelang ho khetholla ubiquitin ho li-modifiers tse kang ubiquitin - k'hemistri e etsang qeto ea hore na ketsahalo e lebisitsoeng ea ho senyeha e hlile e etsahetse..
-
Li-substrates tsa degradation jara tatellano e hlokisang botsitso kapa ea degron e le hore tahlehelo e tsamaisoang ke motsoako kapa e itšetlehileng ka proteasome e hlahise phetoho ea matšoao a ka lekanyetsoang..
E 'ngoe le e' ngoe ea likarolo tsena e sebetsana le lintlha tse nyane tsa sebopeho: eo masalla a ngotsweng, moo ho dulang phetoho, hore na khokahano ea isopeptide kapa oxester e nepahetse, le hore na hlooho ea ntoa e teng sebakeng se nepahetseng. Sesebelisoa seo "95% ea bohloeki" ba sona se patang ntho e hlahelletseng kapa e hlakotsoeng e ka fetola setlamo., botsitso, kapa sekhahla se bonahalang sa ho theoloa se lekaneng ho fetola tlhaloso ea skrine kaofela.
Li-Peptide Tse Ngotsoeng li Hloka Tiiso e Ikhethileng ea Label
Letlapa la fluorescent kapa biotin ha se tlatsetso e sa sebetseng. Conjugation e fetola nako ea ho boloka le ionization ho chromatography, mme e hlahisa phetoho e ka lebelloang ea bongata - empa ha feela mefuta e reriloeng e le eona e thehileng.
Reagent boleng mona ho bolela ho tiisa ea ngodisitsoe mefuta, eseng feela peptide ea motsoali. Seo hangata se hloka:
-
Peptide Synthesis netefatso ea mass-spectrometry ea label e ekelitsoeng ka phetoho e lebelletsoeng ea boima;
-
LC-MS kapa UPLC e hlahloba ho netefatsa hore molek'hule e ngolisitsoeng e ea kokobela le ho ionize joalo ka ha e hlalositsoe., mefuta e ka sehloohong;
-
tlaleho ea boitsebiso e arohaneng bakeng sa leibole, hobane boits'oaro ba eona bo fetotsoeng bo ka pata lihlahisoa tsa lehlakore tse kopaneng.
Bakeng sa biotin, khathatseho ke ho ntlafatsa botšepehi: lotho e ngotsoeng ka mokhoa o itseng kapa e fosahetseng-biotinylated e ka tlama streptavidin ka tsela e fapaneng mme ea theola sete e fosahetseng ea liprotheine.. Bakeng sa fluorophores, mokhoa oa ho hloleha o fapane empa o sitisa ka mokhoa o ts'oanang - ho se hloeke hoo autofluoresces ho assay wavelength e etsisang lets'oao la 'nete mme e phahamisa litheko.. Li laboratori tse hlahlobang li ntse li kopa barekisi ho tlaleha boima bo nepahetseng le chromatogram ea conjugate ea ho qetela., eseng feela tatellano ea bohloeki.
Liphetoho tse Khethehileng tsa Assay li tlameha ho netefatsoa, Eseng Khopolo
Li-reagents tsa degradation hangata ha se li-peptide tse hlakileng. Li na le likarolo tsa ubiquitin-mimetic kapa NEDD8-mimetic, lihlooho tsa ntoa tsa electrophilic, affinity handles, lihokela, le lipara tsa FRET kapa fluorogenic. Boima ba bopaki bo holim'a ho tiisa hore the reriloeng sebopeho se laola lotho le hore ha ho na isomer e sa lebelloang, thitelo, kapa sehlahisoa se ka thoko se bokelletse boemong bo ferekanyang tekolo.
Bakeng sa lehlakore le lenyenyane la molek'hule ea degraders, mokhoa oa ho hlahloba o se o hlakile: sephutheloana se matla se sebelisa LC-MS kapa HPLC bakeng sa bohloeki ba lintho tse phelang, NMR kapa qNMR bakeng sa sebopeho le tekanyo ea boima, 'me hangata tlhahlobo ea chiral kapa ea tšepe ho ts'oara epimerization ea stereocenter le litšila tsa tšepe tse ka timang khokahanyo ea zinki.. Li-peptide le li-reagents tsa protheine tse fepa li-skrini tse tšoanang li lokeloa ke taeo e tšoanang - netefatso ea sebaka sa ntlafatso., netefatso ea khokahano le termini, le ho hlakisa hore na ho se hloeke ho ka sehloohong ho ka kena-kenana le thuto ea baeloji.
Tatelano Botšepehi Ha e Buisanoe
Lilaebrari tsa tlhahlobo le li-probe sets hangata li laeloa khahlano le sebopeho sa mantlha se kenyelletsang degron., mokgoa wa kananelo, sebaka se sehiloeng sa enzyme, kapa sesupo se itshetlehileng ka phosphorylation. Sequence fidelity e bolela hore sebopeho ke sona se rometsoeng - ntle le ho hlakoloa, ha ho sebaka, ha ho kopanelo e fosahetseng, mme hantle N- le C-termini.
Botšepehi ke moo likhaoletso tsa sehlopha sa lipatlisiso hangata li hlahang teng. Morekisi ea tiisang boima ba 'mele a le mong a ka fetoa ke isomere ea ho hlakoloa e nang le boima bo tšoanang, kapa sebaka sa phospho se kentsoeng masala a fosahetseng. Botšepehi ba boemo ba tatelano bo hloka 'mapa oa peptide kapa karohano ea MS/MS, tlhahlobo ea amino-acid bakeng sa sebopeho, le - bakeng sa meaho e fetotsoeng haholo - netefatso ea hore sehlopha ka seng se kentsoeng se lutse sebakeng se reriloeng. Ha skrini sa degrader se hlolehileng kapa sephetho se makatsang sa DUB se khutlela morao ho "tatellano ea substrate e fosahetse ka masala a le mong.,” litšenyehelo ke libeke tsa data e sa khoneheng eo ho seng software e tlase e ka e lokisang.
Netefatso ea Orthogonal Analytical E Tsosa Boitšepo
Letšoao le le leng la tlhahlobo ha se hangata le rarollang boitsebiso. Tataiso ea European Medicines Agency mabapi le ntshetsopele Li-Peptide tsa Synthetic le tlhahiso ea li-peptide tsa maiketsetso li khothaletsa bonyane mekhoa e 'meli ea orthogonal bakeng sa ho tsebahatsa, le boholo ba orthogonal-, qosa-, le mekhoa e thehiloeng ho hydrophobicity bakeng sa sebopeho sa bohloeki.
Netefatso ea Orthogonal e bohlokoa haholo bakeng sa li-reagents tse ngotsoeng le tse fetotsoeng ho feta li-peptide tse otlolohileng., hobane ha ho mokhoa o le mong oa chromatographic o rarollang lelapa le leng le le leng le litšila. Setsebi sa k'hemistri se hlahlobang moaho o rarahaneng oa tlhahlobo hangata se tla kopanya HPLC ea morao-rao le k'hemistri ea kholomo ea bobeli., kopanya tiiso ea bongata le MS/MS kapa 'mapa oa peptide, 'me u kenye mekhoa e reriloeng joalo ka karohano ea chiral bakeng sa stereochemical integrity kapa ho se kenyelle boholo ka ho hasanya mabone a mangata bakeng sa boemo bo kopaneng.. Ha reagent e fepa palo ea ho bala, bopaki bona bo lekantsoeng ke bona bo u lumellang hore u tšepe hore litlaleho tsa boitsebiso le bohloeki ke tsa 'nete ebile li ka hlahisoa - ha se karolo e le 'ngoe ea sebaka se phahameng..
Lilaebrari tsa ho hlahloba li phela kapa li shoe ka Batch Consistency
Lilaebrari tse hlahlobang li hahiloe ka liliba tse ngata, linkho tse ngata, le - ntle le haeba o rera esale pele - lotho e ngata ea tlhahiso. Phapang ea batch-to-batch ke 'molai ea khutsitseng oa li-skrini tsa longitudinal, hobane ho hoholeha ka litšila tse nyane kapa menoana e fetotsoeng ea chromatographic e fetola boits'oaro le ha sehlopha se seng le se seng se fetisa bohloeki ba sona..
Taeo ea tumellano e na le likarolo tse tharo:
-
Tse ngata tsa traceability - pial e 'ngoe le e 'ngoe kapa poleiti ea laebrari e hokahana le sesupo sa batch e nepahetseng le setifikeiti se ikhethileng sa tlhahlobo, kahoo sephetho leha e le sefe se ka saloa morao ho thepa e se hlahisitseng.
-
Papiso ea menoana - lotho e ncha e bapisoa le lotho ea pele le litekanyetso tsa litšupiso ka nako ea ho boloka, boima, le boemo bo sa hloekang, eseng feela ka palo ea ho feta/ho hloleha ho hloeka.
-
Lintlha tse ngotsoeng tse tala - bopaki ba sepheo (chromatograms, ponahalo ea bongata) e fanoe ka beche ka 'ngoe ho fapana le peresente ea kakaretso, kahoo li-laboratory tse hlahlobang li ka ikahlola ka botsona. Tlhahiso ea Peptide
Molao o sebetsang bakeng sa laeborari e kholo ea degrader kapa probe ke ho tsoa ho molekane ea nkang likhatiso tsa menoana e le tloaelo mme a ka bonts'a hore na lotho e fanoeng e bapisoa joang le e netefalitseng lipina tsa hau tsa pejana..
Protheine-Degradation Screening Grade: Seo "Ho Leka ho Leka" se shebahala joang ha u le Mohloli
U ka fetolela tsena tsohle ho sete e khuts'oane ea litebello ha u bua ka reagent kapa u lekola morekisi.. Ka tshebetso, Labs tse tsamaisang degradation workflows batla balekane ba tla buisana ka QC ka mor'a fanoeng tloaelo ea peptide synthesis laela ho ena le ho fana ka palo e le nngwe ya bohlweki.
Lintho tsa bohlokoa li: boitsebiso bo netefatsoang ke boima bo fetang bo sa fetoheng; label le phetoho e 'ngoe le e' ngoe e netefalitsoeng ho conjugate ea ho qetela; tatellano ea botšepehi e ngotsoeng ka amino-acid kapa tlhahlobo ea boemo ba 'mapa moo ho hlokahalang; mekhoa ea tlhahlobo ea orthogonal ka mor'a bohloeki le litlaleho tsa sebopeho; a tlhahlobo ea peptide rekoto e kenyelletsang li-chromatogram tse tala le ponahalo ea bongata ka lotho; le ho tsitsana ha likhatiso tsa menoana ea batch ho bolokoa laebraring eohle.
Sethala se tsebahalang sa synthesis se tla tlisa karohano ea sehlopha sa orthogonal, Netefatso ea boemo ba MS/MS, endotoxin le meeli ea bioburden, le litokomane tsa boemo bo bongata tafoleng - hobane ke phapang pakeng tsa reagent e hlahisang skrine e hloekileng le e khutsitseng e hlahisang lintlha tsa bohata ho pholletsa le liliba tse lekholo..
Key Takeaway: Ho hlahlojoa ha protheine-degradation, boleng ba reagent ke bonnete ba tlhahlobo. Netefatsa mefuta e ngotsweng ho ya ka tatelano ya motswadi, netefatsa sebaka se seng le se seng sa phetoho, sebelisa mekhoa ea tlhahlobo ea orthogonal, le ho tiisa tumellano ea likhatiso tsa menoana - hobane se baloang se tla bonts'a ka khutso hore na ke efe ea tsena e tlotsoeng.
Mehato e Latelang
Qala ka ho ngola litlelase tsa reagent skrineng sa hau se ipapisitse le - motlalehi, hlahloba, kapa substrate - le litokomane tsa tlhahlobo tseo e mong le e mong a li hlokang. Sebelisa seo e le motheo ha u qala, 'me u kope barekisi hore ba u tsamaise ka mekhoa ea orthogonal le bopaki bo bongata ba menoana ka morao ho thepa eo u tla tloha u e sebelisa.. Metsotso e 'maloa e sebelisitsoeng ho hlahloba QC ka pele e ka u pholosa ho tsoa sephethong se ke keng sa khoneha sa tlhahlobo se nkang libeke hore u phomole..
