Enzymatic Peptide Synthesis — Kakaretso ea Morero bakeng sa Junction-Specific Ligation
Peptides Ghk Cu Tharollo ea Peptide Tlhahiso ea enzymatic ligation e lokela ho qala ka setšoantšo sa bond le masala a setseng sehlahisoa.. Lebitso la enzyme le hlaha la bobeli. Motho ea thusang a ka ikopanya le balekane ba teng ka nepo ha a siea sehokelo se fetolang teko. Potso e sebetsang ke hore na litlhoko tsa eona tsa substrate, mateano a ho qetela le karohano e ka tlaase ho noka kaofela li lumellana le molek'hule e reriloeng.
Bakeng sa merero e mengata, papiso e utloahalang ke enzyme-mediated ligation khahlano le tsela ea lik'hemik'hale. Ka bobeli li ka kopanya likhechana tse lokiselitsoeng, 'me ka bobeli li ipapisitse le meaho e fumanehang lipheletsong tse arabelang. Tsela e ratoang ke eona e ka tlisang le ho netefatsa sehlahisoa se hlokahalang tlas'a maemo a lumellanang.
Papiso mona e amana le likarolo tse lokiselitsoeng tsa lipatlisiso le mateano a tsona a ho qetela. Meralo e sebelitsoeng ke ea boikaketsi; ba hlalosa seo ba lokelang ho se theha pele ba laela mofofisi oa sefofane, ho e-na le ho bolela esale pele kotulo ea sepheo se secha kapa ho fana ka maemo a karabelo.
Polelo e arohaneng, ho sebetsa, le ligation
Recombinant expression e fetolela selelekela kapa fusion ka tsela ea ribosomal. Kholo ea ketane ea Ribosomal ke N ho ea ho C. Ts'ebetso e theha meeli e holileng kapa termini e sebetsang e hlokahalang bakeng sa ts'ebetso e latelang. Enzymatic ligation ke mohato o arohaneng oa ho theha maqhama 'me ha oa lokela ho ferekanngoa le polelo ka boeona.
Nonribosomal peptide biosynthesis e sebelisa li-enzyme tse khethehileng 'me ke sehlopha se seng se ikhethileng. Taba ea hore enzyme e ka theha bond ea peptide ha e bolele hore morero o sebelisa tsela ea nonribosomal peptide synthetase.. Bolela phetoho ea 'nete ea catalyst le substrate.
Ts'ebetso e sebetsang ea mongolo ke: selelekela se itseng kapa sekhechana sa maiketsetso → ho lokisoa ha karoloana e hlokahalang → netefatso ea boitsebahatso ba sekhechana → ho kopanya kapa ho palama baesekele → ho tlosoa ha lintho tse sa sebetsanoang le lintho tse thusang ha ho hlokahala → netefatso ea sehlahisoa se hōlileng. Haeba sekhechana se le seng se hlahisoa, ts'ebetso ea eona ea pele-ho-kholo e ka pele ho heke ea ligation.
Tsela ea sekhechana sa lik'hemik'hale e na le mohopolo o ts'oanang: likhechana tse hlalositsoeng → termini e sebetsang e loketseng → ligation ea lik'hemik'hale → liphetoho life kapa life tse hlokahalang tse latelang → tlhoekiso → netefatso ea sebopeho le ts'ebetso. Tsela e lokela ho bapisoa le sehlahisoa sa ho qetela se amohelehang, eseng sebakeng seo lets'oao la karabelo le hlahang pele.
Bapisa litlhoko tsa kananelo le sebopeho sa sepheo
| Atamela | Seo tsela e se hlokang | Ha e ka lekana | Se tlamehang ho hlahlojoa |
|---|---|---|---|
| Transpeptidation ea mefuta-futa | Motifi oa ho tseba o lumellanang le molekane oa nucleophilic bakeng sa sistimi e khethiloeng ea mofuta | Sephutheloana se ikhethileng sa sebaka ha tatellano e hlokahalang ea mateano e amoheloa | Kemohelo-sebaka sa phihlello, tatellano ea lihlahisoa, lihlahisoa tse hlolisanoang, le ho tlosoa ha likarolo tse setseng |
| Asx-specific ligase joalo ka butelase 1 | Tsebo e loketseng ea substrate le moelelo oa tatelano ea terminal | Meetso e khethiloeng ea cyclization kapa intermolecular ligation e tsamaellanang le enzyme | Khokahano e ikhethileng ea substrate le bopaki ba khokahano e reriloeng |
| Native chemical ligation | Ka mokhoa oa eona oa khale, peptide thioester le molekane oa N-terminal cysteine | Ho kopanya fragment ha mateano le ho lokisa sekhechana li lumellana | Kenya lihlopha tsa ho qetela, boitsebiso ba sebaka sa ligation, maikutlo a mahlakore, le liphetoho life kapa life tsa morao-rao tsa sebopeho |
Ho Protocol ea Guimaraes le basebetsi-'moho le bona ba mefuta-futa, temoho ea motif ea LPXTG e kopantsoe le molekane ea loketseng oa oligoglycine. Tatelano ke a Li-capsules tsa Peptide tšitiso ea moralo oa lik'hemik'hale, eseng tag eo ho ka nahanoang hore e nyametse. Thala selelekela, hleka moeli le ho boloka sehokelo ka thoko e le hore mokhoa oa ho hokela o se ke oa fetoha phetoho e sa boleloang ho sepheo..
Ngola sehlahisoa ho e-na le ho ngola feela moelelo oa kananelo
Bakeng sa moralo o lumellanang oa mofuta o inahaneloang, ngola mofani e le protheine–LPETG–mohatla ’me ea e amohelang e le GGG–motlalehi. Ho phunya moeling oa threonine-glycine le sehokelo sa moamoheli eo ho ne ho tla siea protheine-LPET-GGG-motlalehi.. Mohatla oa mofani ha o bolokehe, athe masala a glycine ea amohelang a. Leano lena le hlalosa khokahano; ha e fane ka bonnete ba hore substrate e lokisitsoeng ea fumaneha kapa e sebetsa.
Joale bapisa sehlahisoa seo le potso ea baeloji. Motlalehi ea behiloeng hole le sebaka sa lipuisano a ka amoheloa thutong e le 'ngoe, athe mesaletsa e tšoanang e ka etsa hore thuto ea "terminus" e nepahetseng e se ke ea sebetsa. Rarolla khetho eo ea mahlale pele u toloka kopano e atlehileng e le katleho ea morero. Haeba ho se sehokedi se dumelletsweng, ngola seo e le tšitiso ea khetho ea tsela.
Butelase ea mantlha ea Nguyen le basebetsi mmoho 1 boithuto e bonts'a cyclization e itšetlehileng ka Asx le ligation ka li-substrates tse khethiloeng. E fana ka lebaka la ho hlahloba moralo o lumellanang, ho ena le tiiso bakeng sa peptide e sa amaneng. Hlalosa hore na ke lintho life tse sebelisoang le tse setseng; tlhaloso e pharaletseng ea ts'ebetso ea enzyme e ke ke ea nkela akhaonto ea boemo ba sehlahisoa sebaka.
Boithuto ba Dawson le basebetsi mmoho le bona ba native chemical ligation e fana ka k'hemik'hale ea lik'hemik'hale e thehiloeng ho likhechana tse lokiselitsoeng hantle. Ke khokahano ea ho qetela ea amide e hlalosoang e le ea tlhaho. Ho mena le oxidation e ne e le ts'ebetso e arohaneng pontšong, kahoo sebopeho se nepahetseng sa bond ha sea lokela ho hlahisoa e le bopaki ba hore sepheo se secha se se se ntse se e-na le sebopeho se mennweng se hlokahalang. Lebenkele la Peptides
Ho pholletsa le litsela tse tharo kaofela, nahana ka solubility le ho fumaneha ha likhechana tsa sebele tse arabelang. Tatelano e lumellanang le theory e ntse e ka ba thata ho e sebelisa haeba thepa e lokisitsoeng e sa lule e fumaneha tlasa maemo a reriloeng.. Ho khonahala ha litsela ho kenyelletsa tlhoekiso le ho hlaphoheloa hammoho le ho theha bond.
Bapisa ho sokoloha le sehlahisoa se ka hlaoleloang
Ho mofofisi ea inahaneloang, e abetsoeng 100 Nmol ea molekane ea fokolang e kenya karabelo. Mokhoa o loketseng oa palo o abela 80 nmol ho conjugate e reriloeng pele ho ho itšehla thajana, empa feela 45 nmol e fumanoa ka letamong la ho qetela le amohelehang. Phetoho ho sehlahisoa se abetsoeng ke 80% motheong oo oa ho kenya; ka thoko ho hlaphoheloa ke 45%; ho hlaphoheloa ha sehlahisoa se seng se thehiloe ke 45/80, kapa hoo e ka bang 56%. Lichelete tsena tse iqapetsoeng li hlalosa lintlha tse tharo tse fapaneng.
Ka hona, tsela e phahameng ea phetoho e ka lula e sa khahle haeba sehlahisoa le moqolotsi oa litaba tse feteletseng ho le thata ho arohana. Ka lehlakoreng le leng, phetoho e mpe ea karabelo le tlhoekiso e ntle e lokela ho lebisa nts'etsopele ho tlhahiso ea substrate kapa sebopeho sa bond. Lekanya palo ea limolek'hule tse bapisoang ka mekhahlelo e amehang; libaka tse phahameng tse tsoang ho matrices a fapaneng ha li fane ka linomoro tsa palo ena ka bo eona.
Kakaretso e khuts'oane bakeng sa projeke e ikhethileng ea mateano
Morero oa boikaketsi. Sehlopha se batla ho hokela moqolotsi oa litaba oa maiketsetso oa peptide sebakeng sa C-terminal sa protheine ea lipatlisiso e hlahisitsoeng. Boithuto ba mahlale bo lumella tatellano e hlalositsoeng ea sehokelo ho Peptides Ghk Cu boemo boo, empa sehlopha ha se eso e khethe. Ho feto-fetoha ha maemo ho etsa hore enzyme-mediated ligation e tšoanelehe ha e bapisoa le tsela e nepahetseng ea lik'hemik'hale; ha e fane ka bopaki ba hore enzyme e itseng e tla sebetsa.
Tlatsa likarolo tse latelang pele u kopa khothaletso ea tsela. Tlosa mongolo oa mohlala ka tlhahisoleseling ea morero 'me u boloke lintho tse sa rarolloang ho fapana le ho hakanya.
| Tšimo e khuts'oane | Keno ea projeke e ka tlatsang | Hobaneng ha sehlopha se e hloka |
|---|---|---|
| Sepheo sa mahlale | [Assay le sephetho seo conjugate e tlamehang ho se tšehetsa] | E hlalosa hore na ke liphetoho life tsa sebopeho le litsamaiso tse amohelehang |
| Sebopeho sa ho qetela sa limolek'hule | [Liprotheine le tatelano ea peptide, termini, tlhophiso, le sehokelo sa moqolotsi oa litaba] | E thibela tsela e khahlehang ho fetola sepheo ka khutso |
| Ho tenyetseha ha mateano | [Hantle-ntle mateano a hlokahalang, kapa masalla a likhokahanyo a lumelletsoeng ka ho hlaka] | E etsa qeto ea hore na litlhoko tsa temoho ea enzyme li ka amoheloa |
| Likhechana tse fumanehang | [Mohloli, boemo ba ho sebetsa, lihlopha tsa ho qetela, palo motheo, le bopaki ba tlhahlobo] | E bontša hore na li-substrates tse hlokahalang li teng |
| Litšitiso tsa ho lumellana | [Mefokolo e tsebahalang ya ho mena, mabitso, disulfides, ho qhibiliha, le ho tshwara] | E hlwaya maemo kapa diphetoho tse hlokang ho hlahlojwa |
| Phano ea ho qetela | [Chelete e hlokahalang ea sepheo, tlhabollo, aliquots, litlaleho, le tšebeliso e reretsoeng] | E hokahanya mantsoe a qotsitsoeng ho potoloha ntlha e tšoanang |
| Bopaki ba ho amohela | [Boitsebahatso ba mateano, likarolo tse setseng, sebopeho se amehang, le ditaolo tsa tshebetso] | E hlalosa seo e ka bang projeke e atlehileng |
Bakeng sa morero ona oa boikaketsi, sortase e fetoha mokhethoa haeba mateano a nepahetseng a tsoang ho ananelo a amoheleha 'me a fumaneha. Haeba potso ea mahlale e hloka hore ho be le mateano a nepahetseng ao tsela ea enzyme e tla fetoloa, sehlopha se lokela ho hlahloba tsela bocha kapa se khethe mokhoa o mong o loketseng. Ha ea lokela ho hlalosa sepheo se khutsitseng hore se lumellane le catalyst.
Ka mokhoa o ts'oanang, tsela ea lik'hemik'hale e hlokang thioester kapa terminus e 'ngoe e sebetsang e tlameha ho kenyelletsa boitokiso le sebopeho sa eona. Ho bapisa feela mohato oa ho qetela oa ligation ho ka siea mosebetsi o ka 'nang oa etsa qeto ea ho khoneha, litšenyehelo, le kemiso.
Botsa lipotso tse hlano tse pepesang qeto ea 'nete ea tsela
- Ke tatellano efe e nepahetseng ea bond le masalla e tla sala mateanong ka mor'a mohato o mong le o mong oa ts'ebetso?
- Ke litšobotsi life tsa likhechana tsa rona tse tšehetsang ho lumellana le enzyme e reriloeng kapa tsela ea lik'hemik'hale?
- Sehlahisoa se reriloeng se tla khetholloa joang ho lihlahisoa tsa hydrolysis, makumane a sa sebetsanoeng, le likhokahano tse ling?
- Joang tla catalyst, li-reagents tse thusang, le thepa e feteletseng ea molekane e tlosoe kapa e lekanngoe moo ho leng bohlokoa tekong?
- Ke sephetho sefe se ka etsang hore sehlopha se fetole tsela ho fapana le ho pheta maemo a tšoanang?
Lipotso tsena li etsa hore ho se kholisehe ho ka sebetsa. Haeba tlhokomeliso ea substrate e sa rarolloe, mohato o latelang ke thuto e lebisitsoeng ea ho lumellana. Haeba ho tsebahala ho tšehetsoa empa tlhoekiso e thata, bothata ke karohano e tlase. Haeba mateano a nepahetse ka lik'hemik'hale empa mosebetsi oa fetoha, phuputso e lokela ho hlahloba liphello tsa moralo le tsa tlhahlobo ho e-na le ho nka hore ligation e hlōlehile. Laboratori ea Litšebeletso tsa Phetoho ea Peptide
Fana ka mokhanni oa lifofane qeto e le 'ngoe ea ho e rarolla
Arola tlhahlobo ea kananelo ho tsoa tekong ea ho qetela ea conjugate. Mofofisi oa pele a ka 'na a botsa hore na li-substrates tsa sebele li theha mateano a hlokahalang ka profil ea sehlahisoa e ka tolokoang. Lipapiso tse loketseng li ka kenyelletsa balekane ba arohaneng le motsoako o se nang enzyme, ka tshekatsheko e kgonang ho kgetholla thepa e qalang ho sehlahiswa. Karabo e tsoang ho motsoako o kopantsoeng feela e ka 'na ea nkoa e le phoso e le "covalent attachment"..
Haeba potso eo e rarollotsoe empa conjugate e ka thoko e itšoara ka tsela e fapaneng, suthela ho ditaolo tse kgethollang ditlamorao tsa sehokedi, liphello tsa moqolotsi le boitšoaro ba motsoali-protheine. Ho pheta-pheta teko ea kananelo ho ke ke ha araba lipotso tseo hamorao. Hlalosa hore na ke phumano efe e tla emisa tsela ena: tatellano e bolokoang e sa amoheleheng, khokahanyo e 'ngoe e sa rarolloang, kapa karohano e sa khoneng ho fana ka boitsebiso boo tlhahlobo e bo hlokang.
Sebelisa bopaki bo ikemetseng bakeng sa topology ha ho hlokahala cyclization. Boima bo lumellanang le tahlehelo ea ho theha bond ha bo bolele hore na ke liathomo life tse hokahaneng. Morero oa tlhahlobo o lokela ho sebetsana le selikalikoe kapa mateano a reriloeng le mekhoa e meng e tšepahalang.
Kenyelletsa litsamaiso tse nepahetseng tsa ts'ebetso, joalo ka motsoali ea sa fetoloang, taolo ea moqolotsi oa litaba kapa balekane ba amehang, le papiso e lekang hore na sehokedi se fetola tekolo. Boitsebiso ba lik'hemik'hale le mosebetsi li amana empa lipotso tse fapaneng tsa ho amoheloa. Conjugate e sebetsang ha e fetohe ka bo eona, 'me conjugate ea homogeneous ha e loketse ka bo eona bakeng sa tlhaloso ea baeloji.
Romela litaba tse khutšoane tse tlatsitsoeng le lirekoto tsa mohloli oa likhechana tseo ka bobeli. Kopa tlhahiso ea litsela e bolelang mehopolo, bopaki bo reriloeng, le lintlha tse emisang. Seo se fa sehlopha sa tekheniki bothata ba konkreite ho rarolla le ho fa laboratori sephetho seo se ka se hlahlobang.
Lipotso tse botsoang khafetsa
Ke enzymatic ligation e ts'oanang le polelo ea recombinant? Che. Polelo e hlahisa selelekela kapa protheine ka phetolelo; ligation e kopanya li-substrates tse loketseng phetohong e fapaneng. Morero o ka sebelisa bobeli.
Na litsela tsa enzyme li lula li khetha ho feta litsela tsa lik'hemik'hale? Selectivity itšetlehile ka catalyst, substrate, le maemo. Tlhokomeliso ea enzyme e ka ba ea bohlokoa, empa ho hlokahala motifs, diketso tse hlodisanang, mme sehlahisoa sa ho qetela se ntse se hloka ho netefatsoa.
Ho thoe'ng haeba catalyst e sebetsa empa e siea masala a sa batleheng? Eo ke phetoho e atlehileng ea moralo o fosahetseng. Lekola sehokelo se dumelletsweng kapa tsela pele o odara dintho tse ding; sephetho sa karabelo ha se lumelle ho fetola sepheo sa mahlale.
Ke bopaki bofe bo bohlokoa haholo bakeng sa sepheo sa cyclic? Bopaki ba khokahanyo e reriloeng, mmoho le boitsebiso, ditshila tse amehang, chelete, le tshebetso. Boima bo lekanang le bona feela ha bo thehe ring topology.
