介绍
标记肽供应商 肽图片 “以下哪种反应用于产生肽”的问题通常出现在两种情况之一中: 一项多项选择题，其中凝结, 水解, 取代和酯化竞争答案, 或者一个实验台问题，其中教科书方程必须与在 DMF 中运行两个小时的耦合协议相一致. 两种设置都奖励相同的区别. 产生肽键的反应是通过活性羧基碳上的亲核酰基取代形成酰胺键. 大多数课程打印的缩合方程 - 羧基加胺得到酰胺加水 - 是该转化的净化学计量, 不是任何人都按书面方式运行的程序.
瓦解这种区别会产生五个误解, 下面每个都通过自己的机制进行纠正, 证据和边界条件. 第六部分提出了一个反例，该问题根本不适用: 非核糖体肽合成酶, 其中不存在偶联剂和保护基环. 除非另有说明, 这里的每项权利要求均适用于化学品 (非核糖体) 肽的合成, 数值例子是从特定的序列和条件中得出的, 一般不是来自肽合成.
误解 1: “缩合方程就是你运行的反应”
错误是将平衡方程读作配方. 将游离羧酸与游离胺混合得到羧酸铵盐, 并且在水中直接形成酰胺的平衡更倾向于盐而不是酰胺. 当合作伙伴携带发生反应的侧链时，加热驱水并不是一个可行的解决方案, 在这些条件下差向异构或分解.
耦合中实际发生的事情是由两部分组成的序列. 首先，羧基成分转化为亲电性更强的物质——来自碳二亚胺（例如 DCC）的 O-酰基异脲, DIC 或 EDC, HOBt 的活性酯, HOAt 或 Oxyma, 或尿鎓/鏻衍生的活化物质. 然后胺攻击活化的羰基, 并且添加剂或离去基团离开. 开放斯塔克斯 有机化学 §26.7, 九月出版 20, 2023, 正是描述了这一点: 简单的酰胺可以通过用碳二亚胺处理胺和羧酸来制备, 但肽合成更困难，因为许多不同的酰胺键必须以特定顺序形成，而不是随机形成. Bachem 偶联试剂指南 列出了正在使用的活化家族——酰基卤, 叠氮化物, 对称酸酐和混合酸酐, 有或没有添加剂的碳二亚胺——这是一个有用的提醒，“活化”是一类操作, 不是一种试剂.
边界对于考试答案和替补规划很重要. 如果问题询问哪种反应类别产生肽键, 答案是通过活性羧基碳上的亲核酰基取代形成酰胺; 缩合描述了整体原子平衡. 如果问题询问要在烧瓶中放入什么, 方程和类名都不够——试剂, 添加剂, 溶剂, 基础和温度都必须指定, 这些选择就是剩下的部分的内容.
误解 2: “如果你小心的话，保护团体是可选的”
错误是将保护视为良率优化. 这是选择性要求. 每个氨基酸至少含有一个α-胺和一个α-羧基, 大多数还存在侧链亲核试剂——半胱氨酸的硫醇, 组氨酸咪唑, 赖氨酸的ε-胺, 丝氨酸的羟基, 苏氨酸或酪氨酸. 无正交保护, 偶联混合物含有许多反应性亲核试剂，竞争相同的活化羧基, 并且产品分布是统计的而不是序列定义的.
OpenStax 的 Ala-Leu 工作示例使逻辑具体化: 将丙氨酸与亮氨酸偶联, 丙氨酸的胺基和亮氨酸的羧基被屏蔽, 用 EDC 或 DCC 形成所需的酰胺, 然后去除保护基——二肽的五个步骤. 同一来源指出，氨基通常以 Boc 形式携带 (被短暂的强酸如TFA去除) 或者, 更常见的是, 作为Fmoc (删除者 20% 哌啶的DMF溶液), 而羧基通常以甲酯或苄酯的形式存在. 这 维基百科肽合成概述 在战略层面上提出了相同的观点: 通常需要保护基团方案来防止与侧链的副反应, 化学合成通常从 C 端开始，向 N 端进行.
边界条件真实但狭窄. 化学选择性连接方法和短, 独特的功能化片段可以减轻保护负担, 因为选择的反应伙伴只有一对可以结合. 他们不会将其拆下以进行逐步链条组装, 其中生长链和进入的残留物都携带多个反应中心. 有用的诊断: 如果粗色谱图显示由单个残留物质量而不是一个主要产物分隔的峰梯, 问题通常是选择性, 试剂不足.
误解 3: “活化和偶联是立体化学中性的”
错误在于假设偶联试剂仅影响产物形成的数量. 它还影响立体异构体的形成. 这 分子 杜恩戈等人的评论. (2023; 28:8017) 描述了两种碱催化的构型丢失途径: 直接提取 α-质子以得到烯醇化物，该烯醇化物可以从任一面重新质子化, 和恶唑-5的形成(4H)-一种来自活化残留物, 当羧基被激活时，这是更常见的途径. 两条途径都汇聚了相同的警告——活化的羧基残基是循环中的最高风险点, 风险由基础实力决定, 空间体积以及活性物质在胺到达之前停留的时间.
该评论自己对比较数据的总结值得引用，其范围完整. Gly-Phe-Pro-NH2 的固相合成, 报道的差向异构化是 29.8% 含 EDC/HOAt, 24.1% 与 EDC·HCl/HOAt 和 4.2% 与 DIC/HOAt. 这些是根据引用的初步研究编制的单模型序列图; 他们没有建立 EDC 与 DIC 跨序列的一般排名, 其他地方的评论指出，在某些比较中，EDC 和 DCC 之间的差异微乎其微. 一秒钟, 单独归属的数据点来自比较组氨酸衍生物的供应商技术文档: Fmoc组氨酸(特鲁特)-OH 与 HCTU/6-Cl-HOBt/DIPEA 偶联得到 1% 没有预激活的外消旋作用和 7.8% 预激活五分钟, 而Fmoc-His(博姆)-OH 在相同的预激活下给出 0.3%. 这是特定衍生品和条件的供应商比较, 并非声称 Trt 保护不适合组氨酸.
更正的陈述是有条件的: 试剂, 添加剂, 基础时间和预激活时间都会改变差向异构结果, 位移的大小取决于被激活的残基以及偶联的速度. 基本条件下的慢速耦合是激活物质有时间环化的耦合. 因此，必须通过手性分析来测量立体化学完整性, 马菲试剂, 或能够解析非对映异构体的高分辨率色谱法——而不是从看起来干净的耦合中推断出来.
误解 4: “一个纯度数字就可以告诉您序列是正确的”
错误是将纯度百分比读取为身份声明. HPLC 面积% 回答了一个狭隘的问题: 洗脱并在所选波长下检测到的材料的, 主峰中有什么分数? 它没有说明那个峰值是什么. 删除序列, 来自差向异构化的非对映异构体, 或者天冬酰亚胺衍生的副产物可以在一组梯度条件下与靶标共洗脱, 和 分子 审查明确指出差向异构产品具有非常相似的物理特性, 这就是为什么它们很难净化掉. 这 ChemPep Fmoc SPPS 技术指南 从工作流端做平行点: “标准”偶联条件可能会产生不完全偶联和副产物，包括差向异构体, 截短的肽和 Fmoc 过早裂解的产物.
质谱法弥补了部分差距，但不是全部. 观察到的质量与计算出的质量相匹配，确认了成分, 非序列位置 — 具有相同残基含量的扰乱序列给出相同的质量. 位置信息需要串联 MS, 埃德曼降解, 或短肽的 NMR. 分别地, 抗衡离子形式 (大多数目录中默认使用 TFA, 与醋酸盐, 可进行氯化物或铵交换), 水含量和净肽含量与纯度不同, 和一个 98% HPLC 数据没有说明其中任何一个.
边界是验收标准取决于预期用途. 用于体外测定的研究级试剂和用于临床前工作的材料不具有相同的规格, 研究级证书不是药品规格. 下表是一个诊断框架，用于确定哪个分析信号将揭示哪个故障; 这不是经过验证的方法, 和检测限取决于色谱柱, 坡度, 波长和使用的仪器.
桌子: 反应目的, 特征副反应, 和诊断证据
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反应步骤 |
目的 |
潜在的副反应 |
诊断证据 |
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羧基活化 |
将羧基转化为胺可以攻击的物质 |
通过 oxazol-5 进行差向异构化(4H)-一; 与碳二亚胺形成 N-酰基脲; 与侧链亲核试剂的过早反应 |
手性或高分辨率 HPLC 上的非对映异构体峰; LC-MS 中对应于酰基脲的额外质量 |
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酰胺键形成 (耦合) |
将链延长一个残基 |
不完全偶联产生缺失序列; 双重加法; 与脲试剂的鸟苷化副产物 |
−LC-MS 中的 AA 质量转移; +AA质量转移; 特征胍质量 |
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Fmoc 深度 标记肽工厂 保护 |
暴露 Nα-胺用于下一个循环 |
脱保护不完全; 碱性条件下在 Asp-Xxx 处形成天冬酰亚胺; 某些二肽基树脂中间体脱保护后形成二酮哌嗪 |
通过 UV 或 MS 检测残留 Fmoc; +18/−18 Da 模式从天冬酰亚胺环开环到 α- 和β-天冬氨酰产品; 二肽质量损失 |
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侧链脱保护 肽重构 和分裂 |
释放肽并去除侧链保护基团 |
不完全切割留下受保护的残基; Cys的烷基化, 通过裂解混合物阳离子产生 Met 或 Trp |
与保留的保护基团相对应的质量偏移; 加合物质量 |
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最后隔离 |
去除盐分, 抗衡离子交换, 冻干 |
残余三氟乙酸; 高含水量; 净肽含量低 |
离子色谱法测定残留 TFA; 卡尔费休水; 净肽的元素或定量氨基酸分析 |
标题: 诊断框架, 不是经过验证的协议. 每个信号都表明要寻找什么; 给定方法能否在相关水平上检测到它取决于该方法自身的限制.
误解 5: “如果耦合有效, 其余批次都很好”
该错误从一个成功的步骤推广到整个批次. 偶联效率取决于序列, 最重要的失效模式表现为缺失的残留物，而不是明显的低产量. 这 分子 评论直接说明模式: 偶联和脱保护效率随肽链长度下降, 产生氨基酸缺失和不完整序列, 带有游离 N 端片段的 C 端激活片段大大增加了差向异构化的机会. ChemPep 指南添加了实际推论，即合成过程中的肽聚集是造成问题的主要原因, 很难预测, 是序列依赖性的, 并且没有通用的解决方案——这就是为什么相同的协议可以在一个序列上正常工作，但在另一个相似长度的序列上失败.
三个序列特征值得特别关注. 长的疏水性延伸促进树脂上的聚集和不完全偶联, 显示为删除序列. Asp-Xxx基序在Fmoc脱保护的基本条件下容易形成天冬酰亚胺, 给定α- 和开环后的β-天冬氨酰产品. 某些二肽基树脂中间体在脱保护后可以环化为二酮哌嗪, 在下一次耦合之前截断链条. 当时这些都没有宣称自己的耦合率低; 每个后来都作为质量转移的杂质出现.
更正的主张是批次质量是通过正交方法的特定批次分析数据确定的, 适当的证据集取决于序列长度, 疏水性及改性含量. 一个短, 亲水性的, 未修饰的肽和具有两个二硫化物的 40 个残基疏水性肽不保证进行相同的释放测试, 并将它们视为等效，这就是看似严格的规范最终却说得很少的原因.
反例: 问题不适用的地方
非核糖体肽合成酶的情况是“哪个反应产生肽”有一个真正不同的答案, 并且化学合成框架不转移. 这 NRPS酶学结构综述 描述了模块化酶，其中每个模块包含一个残基. 氨基酸被腺苷酸化结构域激活为酰基腺苷酸, 然后作为硫酯转移至肽基载体蛋白的磷酸泛硫氨酸臂上, 肽键在带有保守 HHxxxDG 基序的缩合结构域中形成. 末端硫酯酶结构域释放产物.
三个差异使得化学框架不适用. 没有外源偶联试剂——激活是酶促的且依赖于 ATP. 不存在 Nα 保护基循环, 因为载体蛋白保留底物并将其传递到正确的结构域. 立体化学是由酶的选择性而不是激活条件决定的, 这就是 NRPS 途径如何整合 D-氨基酸，而不会出现差向异构化问题 分子 审查. 标记肽批发
该审查明确指出了其自身的局限性, 这些限制应该与反例一起变化. 可用的缩合域结构在活性位点缺乏天然配体, 因此活性位点残基在结合和催化中的确切作用仍有待确定, 并且凝结域的动力学尚未解决. 因此，反例支持结构对比——模板化酶组装与试剂驱动的化学偶联——而不是两者之间的详细机械等效性.
当您无法自己进行分析时，应该提出什么要求
对于委托综合而不是运行综合的读者, 这五个误解转化为一个简短的要求清单. 重点不是要求每个项目对应每个肽, 但为了将证据与序列实际遇到的故障模式相匹配.
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具有方法参数的批次特异性 HPLC. 柱子, 坡度, 波长和运行时间, 因此纯度数字可以被解释而不是被信任. 如何混合肽
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MS 观察到的质量与计算出的质量. 两个值, 所以可以检查比较.
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修饰位点和化学. 哪些残留物带有标签, 使用哪个保护基团, 以及预期的质量转移是什么.
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抗衡离子形式. 大多数目录中默认使用 TFA, 与醋酸盐, 可根据要求提供氯化物或铵交换.
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在序列允许的情况下进行立体化学或含量测试. 易差向异构化残基的手性分析; 通过元素或定量氨基酸分析确定肽含量，其中净肽比面积％更重要.
MOL Changes 使用 HPLC 和 MS 发布数据运行定制合成，并提供可选的含量测定, 适用这些规范的序列的内毒素测试和无菌测试; 定义的顺序和预期用途足以请求符合规格的报价. 此类研究级材料适用于实验室工作，不是药品或批准供人类使用的材料.
披露: MOL Changes 是一家商业肽制造商，对此处讨论的质量标准有商业利益.
来源
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开放斯塔克斯, 有机化学, §26.7“肽合成,》 九月出版 20, 2023. https://openstax.org/books/organic-chemistry/pages/26-7-peptide-synthesis
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杜恩戈, S。, 穆哈吉尔, 中号. 我。, 安绍里, J。, 等人. “肽合成中的外消旋/差向异构化。” 分子 2023, 28:8017. https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC10745333/
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“非核糖体肽合成酶的结构生物学。” PMC4760355. https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC4760355/
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化学肽, 《Fmoc固相肽合成》 (供应商技术文档, 仅用于工作流程描述). https://chempep.com/fmoc-solid-phase-peptide-synthesis/
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巴赫姆, “高效肽合成: 偶联试剂和添加剂指南” (供应商技术文档, 仅用于试剂类别描述). https://www.bachem.com/knowledge-center/efficient-peptide-synthesis-a-guide-to-coupling-reagents-additives/
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组氨酸外消旋比较 (1% / 7.8% / 0.3%): HCTU/6-Cl-HOBt/DIPEA 下 Fmoc-His 衍生物的供应商技术比较, 用作单独归因的数据点, 不作为一般排名.
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实验室经理, “DNA-肽相互作用创造了可能有助于塑造生物学的复杂行为”——评估但未使用, 因为它不解决化学肽键的形成.
常问问题
哪个反应类别形成肽键, 激活会添加什么? 通过羧基碳上的亲核酰基取代形成酰胺键. 活化将羧基转化为更好的亲电子试剂——O-酰基异脲, 活性酯, 或尿素/鏻衍生物质 - 因此胺可以在温和条件下进行攻击. 凝聚方程是该变换的净原子平衡, 不是一个程序.
对于有外消旋倾向的序列，Fmoc 或 Boc 哪个更好? 这取决于残基和偶联条件, 证据并不支持笼统的答案. 这 分子 评论指出 Fmoc 脱保护使用碱, 这与碱敏感残基有关, 而 Boc 化学使用酸; 但同样的评论表明偶联剂, 添加剂和碱的选择通常主导差向异构化结果. 对于特定的序列, 实际的答案是识别高风险残留物并寻求能够检测其差向异构体的分析方法.
肽可以吗 98% 通过 HPLC 纯化，仍然是错误的分子? 是的. 面积％描述了主峰中检测到的物质的分数, 不是那个峰值是什么. 删除序列, 在一组条件下，非对映异构体或共洗脱副产物可能在色谱图中占主导地位. 身份识别需要 MS 加上提供位置信息的技术, 和内容, 反离子和水再次单独测量.
缩合反应是否也描述了细胞和 NRPS 酶如何制造肽? 不. 核糖体和非核糖体生物合成均形成酰胺键, 但通过模板化酶机制——酰基腺苷酸激活, 硫酯与载体蛋白结合, 和缩合域催化——无需外源偶联剂且无保护基循环. 净原子平衡相似; 实现这一目标的化学反应不是.
出版商披露: MOL Changes 提供肽服务并对此主题具有商业利益. 服务范围和能力声明是供应商的声明; 特定构造的可用性和性能需要项目特定的证据.
