Η κατάλληλη μέθοδος διάλυσης είναι ένας σημαντικός παράγοντας για την επιτυχία των πεπτιδικών πειραμάτων. Η ακατάλληλη διάλυση θα προκαλέσει την απώλεια πεπτιδίων και την αποτυχία του πειράματος. Ωστόσο, Η εύρεση της ιδανικής μεθόδου διάλυσης είναι μερικές φορές αρκετά δύσκολη. Ακολουθούν οι μέθοδοι διάλυσης που προτείνονται από τις δύο τεχνικές ομάδες του MOL Changes. μέθοδος
MOL Changes Technology Group Dissolution Guide
Το κύριο πρόβλημα στη διάλυση πεπτιδίων είναι ο σχηματισμός δευτεροταγούς δομής.
Αν και ο σχηματισμός δευτερογενών δομών υδρόφοβων πεπτιδικών αλυσίδων είναι πιο εμφανής, εκτός από τις μικρότερες πεπτιδικές αλυσίδες, αυτό το φαινόμενο συμβαίνει σχεδόν σε όλες τις πεπτιδικές αλυσίδες, ανεξαρτήτως πολικότητας. Επομένως, Η πρώτη αρχή της διάλυσης των πολυπεπτιδίων είναι η χρήση αποστειρωμένου απεσταγμένου νερού ή απιονισμένου νερού (ή νερό χωρίς οξυγόνο εάν το επιτρέπουν οι συνθήκες).
Το διάλυμα πεπτιδίου μπορεί να αντιμετωπίσει βακτηριακή αποικοδόμηση. Για να αποφευχθεί αυτό το φαινόμενο, το πεπτίδιο θα πρέπει να διαλυθεί σε αποστειρωμένο απεσταγμένο νερό, ή φιλτράρεται με μεμβράνη φίλτρου με μέγεθος πόρων από 0.45 ή 0.2 μm για αποστείρωση. Πολυπεπτίδια που περιέχουν Cys, Met, και Trp είναι ιδιαίτερα ευαίσθητα στην οξείδωση, οπότε θα πρέπει να διαλυθούν σε νερό χωρίς οξυγόνο. Το νερό χωρίς οξυγόνο μπορεί να ληφθεί με απαέρωση υπό μειωμένη πίεση με έγχυση αδρανών αερίων (άζωτο, ήλιο, και αργό).
Εάν το πεπτίδιο είναι αδιάλυτο σε καθαρό νερό, Η επεξεργασία με υπερήχους μπορεί να βοηθήσει στη διάσπαση των σωματιδίων και στην αύξηση της διαλυτότητας. Σημείωμα: Η επεξεργασία με υπερήχους θα προκαλέσει θέρμανση του διαλύματος και αποικοδόμηση του πεπτιδίου.
Εάν το πεπτίδιο περιέχει πολλαπλά βασικά αμινοξέα, χρησιμοποιήστε υδατικό διάλυμα οξικού οξέος 1~10%.; για πολύ υδρόφοβα πεπτίδια, χρήση 50% οξικό οξύ.
Εάν το πολυπεπτίδιο περιέχει μεγάλη ποσότητα όξινων αμινοξέων, μπορεί να διαλυθεί σε α 1 να 10% διάλυμα αμμωνίας ή ένα πτητικό αλκαλικό ρυθμιστικό διάλυμα όπως οξικός ή διττανθρακικός αιθυλεστέρας. Η τιμή του pH πρέπει να ρυθμιστεί πριν από τη χρωματογραφία.
Εάν το πεπτίδιο πρόκειται να φορτωθεί στη στήλη, η ποσότητα του οργανικού διαλύτη πρέπει να είναι πολύ μικρή, Διαφορετικά ο χρόνος διατήρησης θα επηρεαστεί σοβαρά.
Εάν το πολυπεπτίδιο είναι πολύ υδρόφοβο επειδή περιέχει πλευρικές αλυσίδες αρωματικών υδρογονανθράκων όπως Val, Leu, Met, Phe, Tyr, Ala, και τα λοιπά., ή είναι ένα ουδέτερο πεπτίδιο, η χρήση μετουσιωτικών μεμβρανών όπως το DMF ή το DMSO μπορεί να βοηθήσει στη διάλυση του πολυπεπτιδίου:
ένα. Μετουσιωτές μεμβράνης υψηλής συγκέντρωσης βοηθούν στη διάλυση του πολυπεπτιδίου καταστρέφοντας τη δευτερογενή δομή του.
σι. Τα μετουσιωτικά μεμβρανών είναι κατάλληλα για την παρασκευή διαλυμάτων πεπτιδικής ανάλυσης, αλλά μπορεί να παρεμποδίσει την έρευνα για τη βιολογική τους δραστηριότητα.
ντο. Το DMF είναι το καλύτερο μετουσιωτικό (η υψηλότερη συγκέντρωση μπορεί να φτάσει 30%), και προστίθεται στάγδην μέχρι να διαλυθεί το πεπτίδιο.
ρε. Κατά τη διάρκεια της χρωματογραφίας ανάστροφης φάσης, Το DMF θα ρέει έξω μαζί με την μπροστινή κορυφή του υγρού έκλουσης. Ανάλογα με τον όγκο της ένεσης, η μέγιστη τιμή μπορεί να είναι πολύ υψηλή. Τα περισσότερα πεπτίδια μπορούν να εκλούονται μέσα σε λίγα λεπτά μετά από μια μεγάλη ποσότητα εκλούσματος DMF. Εάν η πεπτιδική αλυσίδα είναι μικρή και εκλούεται πολύ νωρίς, η ποσότητα του πεπτιδίου θα μειωθεί.
MOL Changes Technical Group II Οδηγός διάλυσης
Πώς να διακρίνετε εάν τα αμινοξέα είναι ουδέτερα, όξινη ή αλκαλική, και να υπολογίσετε τη μέθοδο διάλυσης:
1. Εκχωρήστε κάθε όξινο αμινοξύ στην πολυπεπτιδική αλληλουχία συμπεριλαμβανομένου του ασπαρτικού οξέος Asp (ρε), γλουταμικό οξύ Glu (μι) και Ο-τερματικό καρβοξυλ-COOH ως -1; κάθε βασικό αμινοξύ συμπεριλαμβανομένης της αργινίνης Arg ( R), λυσίνη Lys (Κ), ιστιδίνη His (H) και στο Ν-τερματικό αμινο-ΝΗ2 αποδίδεται μια τιμή του +1; ουδέτερα αμινοξέα είναι 0. Με βάση αυτό, υπολογίζεται η τιμή ολόκληρου του πολυπεπτιδίου, και η βαθμολογία είναι θετική Τα πεπτίδια με αρνητική βαθμολογία ονομάζονται βασικά πεπτίδια, αυτά με αρνητική βαθμολογία ονομάζονται όξινα πεπτίδια, και αυτά με βαθμολογία μηδέν ονομάζονται ουδέτερα πεπτίδια.
2. Εάν πρόκειται για αλκαλικό πεπτίδιο, προσπαθήστε πρώτα να το διαλύσετε με νερό; αν δεν μπορεί να διαλυθεί, προσπαθήστε να χρησιμοποιήσετε 10% – 30% οξικό οξύ; εάν το πεπτίδιο είναι ακόμα αδιάλυτο, προσπαθήστε να χρησιμοποιήσετε καθαρό οξικό οξύ και τριφθοροξικό οξύ TFA (<50 μl) να το διαλύσει, και στη συνέχεια αραιώστε το διάλυμα πεπτιδίου στην επιθυμητή συγκέντρωση.
3. Αν πρόκειται για όξινο πεπτίδιο, προσπαθήστε πρώτα να το διαλύσετε με νερό; αν δεν μπορεί να διαλυθεί με νερό, προσπαθήστε να χρησιμοποιήσετε 13% αμμωνιακό νερό (v/v) να το διαλύσει, και αραιώστε το διάλυμα πεπτιδίου στην απαιτούμενη συγκέντρωση. Εάν η πεπτιδική αλληλουχία περιέχει κυστεΐνη Cys (ντο), δεν μπορεί να διαλυθεί σε αλκαλικό διάλυμα. Δοκιμάστε τις παρακάτω μεθόδους.
4. Τα ουδέτερα πεπτίδια συνήθως διαλύονται σε οργανικούς διαλύτες. Πρώτα, προσπαθήστε να χρησιμοποιήσετε ακετονιτρίλιο (ακετονιτρίλιο), ή μεθανόλη (μεθανόλη) ή ισοπροπανόλη (ισοπροπανόλη) να διαλυθεί; για πολύ υδρόφοβα πεπτίδια, διαλύονται πρώτα με μια μικρή ποσότητα διμεθυλοσουλφοξειδίου (DMSO) και αραιώστε με νερό μέχρι την απαιτούμενη συγκέντρωση; εάν η πεπτιδική αλληλουχία περιέχει κυστεΐνη Cys (ντο), χρησιμοποιήστε διμεθυλοφορμαμίδιο (DMF) ή Ν-μεθυλοπυρρολιδόνη (NMP) για διάλυση. Για πεπτίδια που είναι επιρρεπή στη συσσώρευση, Προσθέστε πρώτα 6Μ γουανιδίνη·HCl ή 8Μ ουρία (Ουρία) να τα διαλύσει, και στη συνέχεια αραιώστε τα στην απαιτούμενη συγκέντρωση.
εικονογραφώ:
1. Προκειμένου να διευκολυνθεί η αποθήκευση και η μετέπειτα χρήση, Συνιστάται η διάλυση του πεπτιδίου σε συγκέντρωση περίπου 1-2 mg/ml.
2. Η συνηθισμένη λυοφιλοποιημένη σκόνη πεπτιδίου μπορεί να αποθηκευτεί στους -20°C για περισσότερο από ένα χρόνο. Για διαλυμένα πεπτίδια, Συνιστάται η μερίδα και η αποθήκευση στους -20°C; εάν η πεπτιδική αλληλουχία περιέχει μεθειονίνη Met (Μ), κυστεΐνη Οξύ Cys (ντο) ή τυροσίνη Tyr (Υ) συνιστάται να φυλάσσεται σε περιβάλλον χωρίς οξυγόνο για την πρόληψη της οξείδωσης.
Συνημμένη λίστα αμινοξέων:
1.Ουδέτερα αμινοξέα: γλυκίνη, αλανίνη, λευκίνη, ισολευκίνη, βαλίνη, κυστεΐνη, μεθειονίνη, θρεονίνη, σερίνη, φαινυλαλανίνη, τυροσίνη, τρυπτοφανικό οξύ, προλίνη, ασπαραγίνη και γλουταμίνη
φάeatures: Αυτός ο τύπος μορίου αμινοξέος περιέχει μόνο μία αμινομάδα και μία ομάδα καρβοξυλίου
2.Όξινα αμινοξέα: γλουταμινικό οξύ, ασπαρτικό οξύ
Χαρακτηριστικά: Αυτός ο τύπος μορίου αμινοξέος περιέχει μία αμινομάδα και δύο ομάδες καρβοξυλίου
3.Βασικά αμινοξέα: λυσίνη, αργινίνη, ιστιδίνη
Χαρακτηριστικά: Αυτός ο τύπος αμινοξέος περιέχει μια ομάδα διαμινοκαρβοξυλίου στο μόριό του; Η ιστιδίνη έχει δακτύλιο αζώτου και είναι ασθενώς αλκαλική, και είναι επίσης βασικό αμινοξύ.
