Где сигнал фосфорилирования на самом деле идет не так
Стехиометрия фосфорилирования по своей природе низкая.. В любой момент времени, только часть пула целевого белка несет специфическое событие фосфорилирования, и эта фракция динамически поддерживается за счет противоположной активности киназ и фосфатаз.. Как а 2015 обзор в Молекулярные биосистемы обобщенный, проблемы, характерные для фосфопротеомики — низкая стехиометрия, потери фосфопептидов при многоэтапном приготовлении, снижение эффективности ионизации, и правильная локализация фосфозитов — все это усугубляется, когда преаналитические переменные не контролируются..
Фосфатазы не останавливаются, когда образец помещается в пробирку.. При температуре окружающей среды, ферментативное дефосфорилирование продолжается посредством лизиса, разбавление, и даже на ранних стадиях денатурации белка, если не будут приняты специальные меры, чтобы остановить ее.. В частности, для фосфорилирования тирозина., эффект хорошо описан в первичной литературе.: в препаратах изолированных мембран Т-клеток, удаление ингибитора протеин-тирозин-фосфатазы, вызывающего Lck, Фюн, Сык, Зап70, и CD3ζ быть быстро дефосфорилируется, и фосфорилирование тирозина β- и γ-катенины были полностью аннулируется лечением фосфатазой при отсутствии ингибитора. А 2019 обзор методов отмечает, что видимый сигнал фосфопептида может падать без ингибитора фосфатазы и повышаться вместе с ним., и рекомендует анализировать образцы с ингибитором и без него при анализе фосфорилирования тирозина.. Величина потерь зависит от контекста — она варьируется в зависимости от белка., салфетка, температура, и задержка перед закалкой - так что не следует сводить ее к единому универсальному проценту. Практические последствия: если протокол обработки проб не предназначен для быстрой и полной остановки ферментативной активности, фосфопротеом, который вы измеряете, не отражает ни биологию, которую вы намеревались изучать, ни последовательный артефакт — он отражает непредсказуемую смесь того и другого..
Преаналитические источники отклонений группируются в пять контролируемых этапов.: время фиксации, дисциплина холодовой цепи, состав буфера для лизиса, исполнение обогащения, и параметры метода ЖХ-МС. Независимое управление каждым этапом, а затем проверяем их как систему, это рабочее определение преаналитической строгости в фосфопротеомике..
Время фиксации и холодовая ишемия: Часы начинаются с резекции
Для тканевой фосфопротеомики, интервал между резекцией и фиксацией, называемый временем холодной ишемии, является единственной наиболее значимой преаналитической переменной.. А 2013 Журнал исследований протеома изучать исследовали ткани печени крыс и мышей, обработанные с различной продолжительностью холодовой ишемии, и пришли к выводу, что длительная задержка приводит к «неспецифическим изменениям фосфопротеома, которые невозможно ни предсказать, ни приписать отдельным белкам». Это не незначительное влияние на несколько сайтов.; это глобальное перераспределение сигнала фосфорилирования, который распространяется на каждом последующем этапе анализа..
Временная шкала еще больше сжимается на уровне сайта.. А 2014 Лабораторные исследования изучать количественная оценка экспрессии фосфоэпитопов в ткани FFPE показала, что сигнал фосфорилированного эпитопа обычно снижается по мере увеличения времени фиксации., с некоторыми эпитопами, демонстрирующими измеримую потерю внутри 30 минуты холодовой ишемии. Последующий 2021 ЧВК исследование холодовой ишемии в опухолевой ткани усилил точку, отмечая, что материал FFPE обычно не подходит для анализа киназной активности или анализа фосфостатуса, когда холодовая ишемия не контролируется..
Из этого свидетельства следуют два практических решения.:
Выбор материала: Свежезамороженная ткань сохраняет целостность фосфопротеома значительно лучше, чем FFPE для открытия фосфопротеомики.. Рабочие процессы FFPE могут использоваться для целевого анализа фосфоэпитопов с использованием проверенных антител или мониторинга выбранных реакций., но только тогда, когда и протокол фиксации, и время холодовой ишемии документированы и находятся в подтвержденных пределах..
Требования к документации: Время холодовой ишемии следует рассматривать как обязательную экспериментальную ковариату., не административная аннотация. Если его невозможно сопоставить в группах сравнения, его следует моделировать как помеху, а не игнорировать.
Примечание по объему: Приведенная выше литература по холодовой ишемии основана главным образом на моделях печени и опухолевых тканей грызунов.; величина и скорость дрейфа фосфопротеома являются матричными- и видозависимые, поэтому приведенные ниже пороговые значения следует рассматривать как отправные точки для повторной проверки для каждого типа ткани, а не как универсальные константы..
Ссылка на консенсус: В этой области опубликовано руководство по минимальной отчетности по подготовке проб для фосфопротеомики в соответствии с Минимальная информация о подготовке проб для фосфопротеомики рамки, и обзоры клинических биообразцов рекомендуют ограничивать холодовую ишемию ниже уровня 30 минут для фосфопротеомных применений. Приведение вашей СОП в соответствие с этими стандартами сообщества позволяет напрямую сравнивать методы в разных лабораториях..
Дисциплина холодовой цепи и конструкция лизисного буфера
За пределами фиксации, каждый шаг от сбора проб до денатурации белка несет в себе ферментативный риск. Практическим средством смягчения последствий является контроль температуры в сочетании с химическим арестом..
Стандартная фосфопротеомика протокол рассмотрен в PMC предусматривает обработку на льду или при температуре 4°C для всех этапов предварительного лизиса и рекомендует хранить при температуре -80°C для клеточных осадок, когда экстракция не является немедленной.. Это не консервативные предпочтения; это требования к несущей способности. Нагревание во время центрифугирования, перенос через трубку при комнатной температуре, или задержки между этапами сбора достаточны для внесения измеримых изменений фосфорилирования, если ферментативная активность также не ингибируется химическим путем..
Выбор ингибитора фосфатазы
Добавление ингибиторов фосфатазы в буфер для лизиса является наиболее широко применяемой стратегией химического ареста., но выбор ингибитора нетривиален. Как Олсен и др.. отмечено в их обзоре PMC методов обогащения, часто необходимо включение ингибиторов протеазы и фосфатазы в буферы для экстракции., и каждый ингибитор фосфатазы обладает уникальной специфичностью.. Фторид натрия преимущественно ингибирует серин/треонинфосфатазы.; Ортованадат натрия является стандартом тирозинфосфатаз.; β-глицерофосфат воздействует на более широкий спектр серин/треонинфосфатаз с более благоприятным профилем совместимости с MS, чем фторид.. Использование одного ингибитора для покрытия всего спектра активности фосфатазы является недооцененным источником сайт-специфической систематической ошибки — определенные подгруппы фосфопротеомов будут систематически недостаточно представлены, если в покрытии ингибитора есть пробелы..
Синтез пептидов Коктейли ингибиторов фосфатазы, разработанные для фосфопротеомики (например, PhosSTOP или эквивалентные комбинации) предпочтительнее одноагентных подходов для рабочих процессов обнаружения. Для целевых рабочих процессов, ориентированных на конкретные узлы сигнализации, Выбор ингибитора может быть обоснован с учетом семейств фосфатаз, наиболее соответствующих изучаемой биологии..
⚠️ Внимание: Удалите ингибиторы фосфатазы перед протеолитическим расщеплением.. Некоторые широко используемые ингибиторы, особенно фторид натрия, влияют на активность трипсина., уменьшение покрытия пептидов и введение систематической ошибки переваривания, зависящей от последовательности. А 2021 ЧВК исследование по подготовке проб фосфопротеомики подтверждает, что перенос ингибитора фосфатазы на стадию пищеварения снижает количество идентифицированных фосфопептидов.
Денатурация лизиса как альтернатива
Для типов проб, где ферментативного ареста недостаточно, особенно когда белковые комплексы или целостность органелл замедляют проникновение ингибитора, — условия денатурирующего лизиса. (8 М мочевина, или лизис на основе SDS с последующим удалением детергента) обеспечить стратегию ортогональной стабилизации. Быстрая денатурация останавливает ферментативную активность более полно, чем подходы, основанные на ингибиторах., за счет увеличения сложности последующей обработки для удаления моющих средств. Для экспериментов на клеточных линиях, где необходимо точно зафиксировать состояние фосфопротеома в конечной точке стимуляции., денатурирующий лизис часто является более надежным вариантом.
Протоколы стабилизации, соответствующие матрице образца
Преаналитические переменные не одинаковы для разных типов проб.. В следующей таблице показаны критически важные вмешательства по матрицам., с критериями приемки для каждого:
|
Образец Синтетические пептиды Матрица |
Ключевой преаналитический риск |
Рекомендуемое вмешательство |
Критерий приемки |
|---|---|---|---|
|
Культивируемые клетки (приверженец) |
Ферментативный дрейф во время трипсинизации / удаление носителя |
Закалка непосредственно на пластине ледяным PBS. + ингибиторы; немедленно аспирируйте и лизируйте |
Время от гашения до лизиса ≤ 5 мин; Гранулы хранятся при температуре -80°C, если не обработаны в тот же день. |
|
Культивируемые клетки (приостановка) |
Задержка гранулирования при температуре окружающей среды |
Немедленно центрифугировать при 4°C.; удалить супернатант на льду; гранулы мгновенной заморозки |
Пеллета не теплее 4°C в любой точке.; замереть внутри 10 минута остановки центрифуги |
|
Кровь (изоляция РВМС) |
Задержка обработки сдвигает фосфопрофиль |
Начать изоляцию РВМС в течение 2 часы розыгрыша; добавьте ингибиторы перед разделением по плотности |
≤ 2 ч. задержка; время задержки документа на пробирку |
|
Биопсия ткани (свежий) |
Холодовая ишемия |
Мгновенная заморозка в жидком азоте внутри 20 мин резекции; документировать время ишемии |
Холодовая ишемия ≤ 20 мин; отклонение помечено как ковариата |
|
Ткань ФФПЭ |
Качество фиксации и время ишемии |
Используйте только образцы с подтвержденной ишемией. < 30 мин. и экспозиция формалином 6–24 ч. |
Исключить или аннотировать все образцы с недокументированным временем фиксации. |
А 2021 Журнал протеомики исследование, отслеживающее влияние задержки выделения РВМС на профили фосфорилирования острого миелолейкоза обнаружили наблюдаемые изменения фосфопротеома после 24-часовой задержки, даже при наличии ингибиторов. Это подчеркивает, почему документирование задержки — это не просто запись о качестве — это экспериментальная переменная, которая может исказить групповые сравнения, если ее не сопоставить..
Переменные обогащения, которые усиливают или ослабляют преаналитический шум
Обогащение фосфопептидами не является нейтральной стадией концентрации.. Каждый параметр обогащения — химический состав смолы, загрузка pH, соотношение пептида к гранулам, строгость стирки, и условия элюирования — взаимодействует с популяцией фосфопептидов, доставленных при подготовке пробы., а плохо контролируемое обогащение может усилить дисперсию, вносимую выше по потоку, маскируя ее за явно чистыми данными МС..
Выбор метода обогащения
Три доминирующих химических вещества — IMAC (Fe³⁺, Га³⁺, Зр⁴⁺, Если⁴⁺), ТиО₂, и последовательный MOAC (СИМАК) — не взаимозаменяемы. Они несут разные предвзятости и по-разному реагируют на преаналитический шум во входной смеси пептидов..
|
Метод обогащения |
Диапазон селективности |
Чувствительность к pH |
Первичное смещение |
Известный режим отказа |
|---|---|---|---|---|
|
Fe/Zr-IMAC |
Очень высокий (>97% в оптимизированных условиях) |
Высокий — необходимо загружать при pH 1,5–2,5. |
Низкая погрешность в отношении многократно фосфорилированных пептидов |
Кислые нефосфопептиды конкурируют, если pH нагрузки слишком высок. |
|
ТиО₂ |
82–99% в зависимости от загрузки добавки |
Умеренный — требует кислотной нагрузки (pH 2–2,5) |
Может смещаться в сторону pSer/pThr по сравнению с pTyr; многократно фосфорилированные виды, обогащенные высоким соотношением гранул |
Добавка гликолевой кислоты может снизить специфичность некоторых протоколов. |
|
Последовательный МОАК (СИМАК) |
Самый широкий охват населения |
Добавка на последовательных этапах |
Последовательное расширение охвата с дополнительными предубеждениями |
Сложность и совокупные потери; настоятельно рекомендуется предварительное фракционирование |
Данные из 2015 сравнительное исследование в ЧВК сравнение многоэтапного IMAC и многоэтапного TiO₂ показало, что три раунда любого метода захватывают большинство обнаруживаемых фосфопептидов из лизатов цельных клеток., с каждым дополнительным раундом, приносящим уменьшающуюся прибыль. А 2024 систематическое исследование оптимизации сообщил >16,000 фосфопептиды, идентифицированные при однократном обогащении при концентрации гликолевой кислоты, процент элюирования гидроксида аммония, соотношение пептида к гранулам, время связывания, и объем выборки были совместно оптимизированы.
Два параметра заслуживают особого внимания, поскольку в опубликованных протоколах они часто не указаны.:
Соотношение пептидов и гранул: Слишком мало смолы преимущественно обогащает многократно фосфорилированные пептиды.; слишком много смолы увеличивает неспецифическое связывание кислых нефосфорилированных пептидов. Количественная оценка стратегий обогащения обнаружили, что TiO₂ лучше всего работает при 1:2–1:8 соотношение пептида к гранулам (ж/б).
Загрузка pH: Специфичность как для IMAC, так и для TiO₂ существенно возрастает, когда загрузочные буферы подкисляются до pH 2–2,5 с помощью TFA или уксусной кислоты.. В одном сравнении POROS-Fe³⁺ и TiO₂, селективность улучшилась с 12–18% до 58–60%. при применении кислотных условий нагрузки.
Использование внутренних стандартов фосфопептидов в качестве ворот контроля качества
Одним из наиболее практичных средств контроля предварительного обогащения является добавление определенной последовательности. стандарты фосфорилированных пептидов в известной концентрации перед обогащением. Восстановление этих стандартов на этапах обогащения и ЖХ-МС обеспечивает количественную проверку эффективности, независимую от сложности эндогенного фосфопротеома.. Если стандартное извлечение падает ниже определенного порога — обычно 50–80 % в зависимости от протокола — цикл обогащения можно пометить перед сбором данных МС., предотвращение напрасной траты времени прибора на скомпрометированный образец.
Для рабочих процессов, требующих согласованности от партии к партии, внутренне непротиворечивый индивидуальный синтез фосфопептидов с подтвержденной ВЭЖХ чистотой ≥ 95% и МС-подтверждение как идентичности последовательности, так и назначения фосфосайтов обеспечивает эталонный материал, необходимый для поддержания этого контроля качества во всех экспериментах..
Параметры ЖХ-МС: Завершающий этап преаналитического контроля
Настройки сбора данных МС обычно рассматриваются как задача оптимизации, независимая от подготовки проб.. На практике, они взаимодействуют с преаналитическим качеством: деградированный образец может оказаться приемлемым при разрешенных настройках сбора данных, в то время как хорошо подготовленный образец может по-прежнему работать хуже при несоответствующих условиях ЖХ.
Длина градиента и выбор столбца
Для сложных, обогащенные смеси фосфопептидов, длина градиента и формат столбца определяют, какая часть фосфопротеома секвенируется.. А 2017 исследование по оптимизации, опубликованное в ПабМед продемонстрировал, что безутешный 50 Колонка см, заполненная 1.9 частицы мкм, работать с оптимизированным градиентом LC, дал >23,000 фосфопептиды с высокой степенью достоверности, представляющий 51% улучшение глубины секвенирования по сравнению с более короткими конфигурациями колонок. Общий консенсус исследований, посвященных конкретным инструментам, указывает на градиент 90–120 минут как практическую золотую середину для фосфопротеомики масштаба открытия с использованием DDA на инструментах Orbitrap высокого разрешения..
Узкопроходные колонны (75 внутренний диаметр мкм или меньше) являются предпочтительными, поскольку повышение чувствительности электрораспыления при уменьшенных скоростях потока частично компенсирует присущую фосфопептидам чувствительность к ионному подавлению.. А 2024 микромасштабное исследование рабочего процесса с одним котлом в Журнал исследований протеома сообщили об улучшении чувствительности в 3,6 раза при переключении с 100 мкм до а 25 см × 75 мкм, 1.7 колонка мкм C18.
Точность фрагментации и локализации
Для локализации фосфозитов, Выбор метода фрагментации имеет прямые последствия для биологической интерпретации.. А 2017 Журнал исследований протеома оценка параметров Orbitrap Fusion пришли к выводу, что HCD с Orbitrap MS/MS высокого разрешения обеспечивает оптимальный подсчет идентификации фосфозитов., в то время как EThcD повышает достоверность локализации для каждого PSM за счет более длительного рабочего цикла и снижения общей производительности идентификации.. Практическое значение: HCD является подходящим значением по умолчанию для рабочих процессов обнаружения.; EThcD оправдан, когда небольшое количество сайтов с неоднозначными оценками локализации требует однозначного определения..
Загрязнение ионами металлов в системе ЖХ
Недооцененным источником потерь фосфопептидов во время анализа ЖХ-МС является образование комплекса фосфопептид-металл в металлсодержащих путях потока.. А 2022 САУ Омега оценка факторов риска системы ЛЦ обнаружили, что компоненты ЖК на основе металлов могут изолировать фосфопептиды до того, как они достигнут источника ESI., добавление ЭДТА к растворителю пробы считается эффективной контрмерой, предотвращающей образование комплексов. Это особенно актуально для лабораторий, которые не используют биоинертные системы ЖХ..
Система преаналитического контроля: Поэтапная таблица решений
Следующая структура организует преаналитические переменные, описанные выше, в управляемую последовательность.. Каждый этап должен быть оценен перед переходом к следующему., с отклонениями, документированными как экспериментальные ковариаты, а не молча отбрасываемыми.
|
Этап |
Переменная |
Критерий приемки |
Действия в случае неудачи |
|---|---|---|---|
|
Коллекция образцов |
Теплая ишемия / задержка сбора |
≤ 20 мин (салфетка); ≤ 2 час (кровь/МКПК) |
Исключить или отметить; документировать время ишемии как ковариату |
|
Фиксация / стабилизация |
Температура на первом этапе обработки |
0–4°C повсюду |
Повторить сбор, если протокол был нарушен; не используйте скомпрометированный образец без аннотации |
|
Лизисный буфер |
Охват ингибиторами фосфатазы |
Коктейль покрывает серин/треонин и тирозинфосфатазы. |
Переформулировать буфер; валидация с пиковым восстановлением стандартов фосфопептидов |
|
Пищеварение |
Перенос ингибитора в гидролизат |
Концентрация ингибитора ниже заявленного порога ингибирования трипсина |
Обессоливание перед перевариванием; проверить покрытие пептидов на репрезентативном образце |
|
Ввод обогащения |
Количественное определение пептидов |
Достаточная входная масса для выбранного соотношения смолы |
Отрегулируйте количество смолы или уменьшите соотношение валиков.; не превышайте утвержденный диапазон соотношения пептид-гранулы |
|
Выполнение обогащения |
Загрузочный буфер pH |
pH 2,0–2,5, подтвержденный индикатором или pH-метром. |
Переделать загрузочный буфер; не продолжайте работу с pH вне этого диапазона |
|
Контроль качества обогащения |
Внутреннее стандартное восстановление |
≥ 50% восстановление стандартов фосфопептидов с добавлением добавок |
Пометить пакет; повторно обогатить, если осталось достаточно образца; сообщить о восстановлении в методах |
|
ЖХ-МС |
Противодавление в колонне и форма пика |
В пределах ±15% от базовой линии; симметричные пики фосфопептидов |
Замените или повторно уравновесьте колонку; проверьте, не устарели ли колонки и не пусты ли они |
|
ЖХ-МС |
Оценка локализации фосфосита |
≥ 75% фосфопептидов с I классом локализации (оценка ≥ 0.75) |
Проверьте специфичность обогащения и калибровку прибора. |
Эта структура не заменяет разработку метода — она обеспечивает структуру аудита, в рамках которой принимаются и проверяются решения о разработке метода..
Готовый к использованию протокол контроля качества
Приведенная выше поэтапная таблица становится действенной, когда каждое критическое значение регистрируется для каждой партии.. Приведенный ниже контрольный список предназначен для копирования непосредственно в лабораторный блокнот или в электронную систему учета., с одним столбцом на образец и документированным полем отклонения:
|
Поле для записи |
Пример значения |
Отклонение / Примечания |
|---|---|---|
|
Идентификатор образца и матрица |
Печень, свежемороженый Производство пептидов |
— |
|
Теплая ишемия / задержка сбора |
14 мин |
в пределах лимита |
|
Время холодовой ишемии |
22 мин |
в пределах лимита |
|
Температура на первом этапе обработки |
4°С |
— |
|
Лизисный буфер + номера партий ингибиторов |
ФосСТОП лот ####; партия НаФ #### |
— |
|
Удаление ингибитора перед перевариванием (Да/Нет) |
Да |
— |
|
Химия обогащения и партия гранул |
ТиО₂, много #### |
— |
|
Соотношение пептидов и гранул |
1:4 (ж/б) |
— |
|
Загрузочный буфер pH |
2.2 |
— |
|
Внутреннее стандартное восстановление (%) |
72% |
выше 50% ворота |
|
Уровень локализации I класса (%) |
81% |
— |
Запись этих полей превращает структуру в воспроизводимую запись качества и делает отклонения проверяемыми, а не невидимыми..
От концепции к воспроизводимым выводам
Целью преаналитического контроля не является методологический перфекционизм.. Это способность сравнивать состояния фосфопротеома в разных образцах., моменты времени, или группы лечения и приписывают наблюдаемые различия биологии, а не обращению с артефактами.. Структура, построенная на контролируемых критериях приемки, документированные отклонения, и внутренние стандарты преобразуют рабочий процесс фосфопротеомики из неявного доверия к соблюдению протокола в явный учет качества.
Стандартизация СОП для типов выборок и для отдельных лиц, собирающих образцы в многоцентровом исследовании, требует определения каждого критического параметра в таблице выше., измеренный, и записано, не просто рекомендуется. Время холодовой ишемии, номер партии ингибитора фосфатазы, партия обогащенных шариков, значения восстановления и внутренние стандарты должны быть указаны в разделе «Методы» любого исследования фосфопротеомики, претендующего на клиническую значимость..
Для команд, создающих или проверяющих эталонные панели по фосфопептидам., Изменения МОЛ пептидные услуги CRO может поддерживать синтез и характеристику стандартов фосфопептидов, специфичных для последовательностей, с полной документацией по ВЭЖХ и МС-КоА., обеспечение материальной основы для последовательного контроля качества во всех экспериментах.
Об этом руководстве и его авторах
Эта статья подготовлена технической командой MOL Changes., чья работа охватывает синтез индивидуальных пептидов, модификация фосфопептида, и аналитическая характеристика (ВЭЖХ и МС) для исследований и CRO-приложений. Представленная здесь структура синтезирует опубликованную литературу по подготовке проб, а не сообщает новые первичные данные.; где мы описываем эксплуатационные пороги, мы указываем, взяты ли они из рецензируемых источников или из практических примеров в наших собственных рабочих процессах синтеза и контроля качества..
Чтобы это руководство было точным и актуальным, он прошел внутреннюю техническую проверку на предмет соответствия стандартной практике подготовки проб для фосфопротеомики.. Читатели, которым требуются учетные данные уровня автора, институциональная принадлежность, или указанный научный рецензент для целей цитирования может запросить пакет технических данных, который включает сведения о рецензенте и документацию по конкретной партии.
Примечание: Личные авторские имена и институциональная принадлежность находятся в стадии завершения.; раздел выше будет обновлен с использованием именованных учетных данных.
Аргумент в пользу преаналитической дисциплины в конечном итоге является аргументом в пользу научной достоверности.. Данные фосфопротеомики, которые невозможно проследить до истории контролируемых образцов, не могут быть достоверно интерпретированы — и не потому, что масс-спектрометр лгал., но поскольку измеряемый им биологический сигнал уже представлял собой смесь биологии и обработки. Создайте структуру перед извлечением. От этого зависят ваши выводы.
Мы занимаемся собственным синтезом и контролем качества, поставляя стандарты фосфопептидов., мы регулярно сталкиваемся с практическими преимуществами этих открытий: извлечение стандартов с добавками заметно варьируется в зависимости от деталей обработки, описанных выше., именно поэтому мы рассматриваем документированную историю проб как неотделимую от аналитического результата.. Вместо одного драматического провала, повторяющийся шаблон — это медленное ухудшение качества сигнала, которое легко не заметить, пока сравнение пакетов не завершится неудачно.. В этой статье мы сформулировали критерии приемки, чтобы отразить эту рабочую реальность., и мы призываем команды регистрировать базовое значение восстановления для своего стандартного протокола, чтобы любое отклонение стало видимым до того, как оно сделает сравнение недействительным..
Готовы обсудить спецификации эталонных пептидов для вашего рабочего процесса контроля качества фосфопротеомики.?
Ссылки
-
Почему фосфопротеомика все еще остается проблемой? Молекулярные биосистемы (2015). https://pubs.rsc.org/en/content/articlehtml/2015/mb/c5mb00024f
-
Регуляция фосфорилирования тирозина в мембране изолированных Т-клеток путем ингибирования протеинтирозинфосфатаз. ПабМед (1998). https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/9712039/
-
Фосфорилирование тирозина и киназы семейства Src контролируют межклеточную адгезию кератиноцитов. ЧВК (1998). https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC2132783/
-
Анализы фосфорилирования тирозина в клетках человека — ЧВК (2019). https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC7379381/
-
Неспецифические изменения фосфопротеома, вызванные холодовой ишемией — Журнал исследований протеома (2013). https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/pr400451z
-
Экспрессия фосфоэпитопов и время фиксации в ткани FFPE - Лабораторные исследования (2014). https://www.nature.com/articles/labinvest2014139
-
Холодовая ишемия в опухолевой ткани: последствия для анализа фосфостатуса — ЧВК (2021). https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC7893972/
-
Стандартный протокол подготовки проб для фосфопротеомики — ЧВК (2012). https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC3332032/
-
Олсен и др., Методы обогащения, используемые в фосфопротеомике - ЧВК (2011). https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC3418503/
-
Подготовка проб для фосфопротеомики влияет на биологическую интерпретацию — ЧВК (2021). https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC8699897/
-
Сравнение многоступенчатого IMAC и многоступенчатого обогащения TiO₂ — ЧВК (2015). https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC4766865/
-
Систематическая оптимизация обогащения фосфопептидами TiO₂ — ЧВК (2024). https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC11087715/
-
Количественная оценка стратегий обогащения фосфопептидов — ЧВК (2016). https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC4849134/
-
Кислотная загрузка улучшает селективность IMAC и TiO₂ — ПабМед (2012). https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22406350/
-
Оптимизация длинноколоночной ЖХ для фосфопротеомики — ПабМед (2017). https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28634120/
-
Рабочий процесс микромасштабной фосфопротеомики в одном сосуде — Журнал исследований протеома (2024). https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jproteome.3c00862
-
Оценка параметров фрагментации для локализации фосфозита — Журнал исследований протеома (2017). https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jproteome.7b00337
-
Загрязнение системы ЖХ металлами и потеря фосфопептидов — САУ Омега (2022). https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsomega.2c05616
-
Минимальная информация о подготовке проб для фосфопротеомики — Предшественники природы (2009). https://www.nature.com/articles/npre.2009.3131.1
Свяжитесь с технической командой MOL Changes через наш пептидные услуги страница для запроса технической консультации или пакета данных по конкретной партии.
