Тейешле иретеү ысулы мөһим фактор булып тора, уңышлы пептид тәжрибәләре .. Дөрөҫ иретелмәү пептидтарҙы юғалтыуға һәм тәжрибәнең уңышһыҙлығына килтерәсәк. Әммә, идеаль иретеү ысулын табыу ҡайһы саҡта ярайһы уҡ ауыр. Түбәндәге тарҡатыу ысулдары тәҡдим ителгән ике техник төркөмө МОЛ үҙгәрештәр .. ысул
МОЛ үҙгәрештәр технологияһы төркөмө тарҡатыу ҡулланмаһы
Пептидтарҙы эретеүҙә төп проблема булып икенсел структура барлыҡҡа килтереү тора ..
Гидрофоб пептид сылбырҙарының икенсел структураларының барлыҡҡа килгәне асыҡыраҡ күренһә лә, иң ҡыҫҡа пептид сылбырҙарынан башҡа, был күренеш бөтә пептид сылбырҙарында ла тиерлек осрай, полярлыҡҡа ҡарамаҫтан. Шуға күрә, полипептидтарҙы эретеүҙең беренсе принцибы — стериль дистиллированный һыу йәки деионлаштырылған һыу ҡулланыу (йәки шарттар мөмкинлек бирһә, кислородһыҙ һыу).
Пептид иретмәһе бактериаль деградацияға дусар булыуы мөмкин. Был күренештән ҡотолоу өсөн ., пептидты стериль дистиллированный һыуҙа эретергә кәрәк, йәки поралар ҙурлығында фильтр мембранаһы менән фильтрлана. 0.45 йәки 0.2 мкм стерилләү өсөн. Составында Cys булған полипептидтар, Осрашты, һәм Trp бигерәк тә окисланыуға бирешә, шуға күрә уларҙы кислородһыҙ һыуҙа эретергә кәрәк. Кислородһыҙ һыуҙы инерт газдар индереү юлы менән кәметелгән баҫым аҫтында газһыҙландырыу юлы менән алырға мөмкин . (азот, гелий, һәм аргон).
Әгәр пептид таҙа һыуҙа эремәй икән, ультратауышлы дауалау ярҙам итә ала, киҫәксәләрҙе тарҡатыу һәм иретеүсәнлеген арттырыу. Иғтибар итергә: Ультратауышлы эшкәрткәндә иретмәнең йылытыуы һәм пептидтың деградацияһы сәбәп буласаҡ.
Әгәр пептидта бер нисә төп аминокислота булһа, 1~10% сироп кислотаһы һыулы иретмәһен ҡулланыу; бик гидрофоб пептидтар өсөн, файҙаланыу 50% сироп кислотаһы.
Әгәр полипептидта кислоталы аминокислоталар күп булһа, уны иретергә мөмкин 1 тиклем 10% аммиак иретмәһе йәки осоусан һелте буферы, мәҫәлән, этил морфин ацетаты йәки бикарбонат. рН ҡиммәтен хроматография алдынан көйләргә кәрәк.
Әгәр ҙә пептидты колонкаға тейәргә кәрәк икән, органик иреткес күләме бик аҙ булырға тейеш, юғиһә һаҡлау ваҡыты етди йоғонто яһаясаҡ.
Әгәр полипептид юғары гидрофоб, сөнки ул составында ароматик углеводород ян сылбырҙары кеүек Val ., Леу, Осрашты, Phe, Тыр, Ала, һ. б., йәки нейтраль пептид булып тора, мембраналы денатуранттар ҡулланыу, мәҫәлән, ДМФ йәки ДМСО полипептидты иретергә ярҙам итә ала:
а. Юғары концентрациялы мембраналы денатуранттар полипептидты икенсел төҙөлөшөн юҡ итеп иретергә ярҙам итә.
б. Мембраналы денатуранттар пептид анализы иретмәләрен әҙерләү өсөн яраҡлы ., әммә уларҙың биологик эшмәкәрлеген тикшерергә ҡамасаулай ала.
в. ДМФ иң яҡшы денатурант булып тора (иң юғары концентрацияһы 100-гә етә ала. 30%), һәм пептид ирегәнсе тамсылап өҫтәлә.
г. Кире фазалы хроматография ваҡытында, ДМФ элюенттың алғы түбәһе менән бергә ағып сығасаҡ. Инъекция күләменә ҡарап, пик ҡиммәте бик юғары булыуы мөмкин. Күпселек пептидтар бер нисә минут эсендә элюирлана ала, күп күләмдә ДМФ элюирланғандан һуң .. Әгәр пептид сылбыры бәләкәй һәм бик иртә элюирлана, пептид күләме кәмейәсәк.
МОЛ үҙгәрештәр техник төркөм II тарҡатыу ҡулланмаһы
Аминокислоталарҙың нейтраль булыуын нисек айырырға, кислоталы йәки һелтеле, һәм иретеү ысулын иҫәпләү:
1. Полипептид эҙмә-эҙлеклелегендәге һәр кислоталы аминокислотаны, шул иҫәптән аспартат кислотаһы Asp тәғәйенләү. (D), глутамин кислотаһы Glu (Е) һәм С-терминаль карбоксил-СООН тип -1; һәр төп аминокислота, шул иҫәптән аргинин Arg ( R), лизин Лис (К), гистидин Уның (Һ) һәм N-терминаль амино-NH2 ҡиммәте бирелә. +1; нейтраль аминокислоталар булып тора. 0. Ошонан сығып, бөтә полипептидтың ҡиммәте иҫәпләнә, һәм балл ыңғай Тиҫкәре балл менән пептидтар төп пептидтар тип атала, тиҫкәре балл менән булғандарҙы кислоталы пептидтар тип атайҙар, ә нуль балл йыйғандарын нейтраль пептидтар тип атайҙар.
2. Әгәр ҙә ул һелтеле пептид булһа, тәүҙә уны һыу менән иретергә тырышығыҙ; әгәр уны тарҡатып булмаһа, ҡулланып ҡарағыҙ 10% – 30% сироп кислотаһы; әгәр пептид һаман да иремәй икән, таҙа сироп кислотаһы һәм трифтор сироп кислотаһы ТФА ҡулланырға тырышығыҙ (<50 мкл) уны тарҡатыу, Һуңынан пептид иретмәһен кәрәкле концентрацияға тиклем һыуытып алырға.
3. Әгәр ҙә ул кислоталы пептид булһа, тәүҙә уны һыу менән иретергә тырышығыҙ; һыу менән иретеп булмаһа, ҡулланып ҡарағыҙ 13% аммиак һыуы (в/в) уны тарҡатыу, һәм пептид иретмәһен кәрәкле концентрацияға тиклем һыуытып алалар .. Әгәр пептидтар эҙмә-эҙлегендә цистеин Cys . (С), уны һелтеле эретмәлә иретеп булмай. Зинһар, түбәндәге ысулдарҙы ҡулланып ҡарағыҙ.
4. Нейтраль пептидтар, ғәҙәттә, органик иреткестәрҙә иретелә .. Беренсе, ацетонитрил ҡулланып ҡарағыҙ (ацетонитрил), йәки метанол (метанол) йәки изопропанол (изопропанол) тарҡатыу; бик гидрофоб пептидтар өсөн, тәүҙә аҙ миҡдарҙа диметилсульфоксид менән иретергә (ДМСО) һәм һыу менән кәрәкле концентрацияға тиклем һыуытып алырға; әгәр пептидтар эҙмә-эҙлегендә цистеин Cys (С), диметилформамид ҡулланыу (ДМФ) йәки N-метилпирролидон (НМП) тарҡатыу өсөн. Агрегацияға бирелгән пептидтар өсөн, тәүҙә 6М гуанидин·HCl йәки 8М мочевина өҫтәйбеҙ (Мочевина) уларҙы тарҡатыу, ә һуңынан уларҙы кәрәкле концентрацияға тиклем һыуытып алырға.
иллюстрация:
1. Һаҡлауҙы һәм артабан ҡулланыуҙы еңеләйтеү маҡсатында, пептидты яҡынса 100 тирәһе концентрацияға тиклем иретергә кәңәш ителә. 1-2 мг/мл.
2. Ғәҙәти пептид лиофилизацияланған порошок һаҡларға мөмкин -20°C бер йылдан ашыу. Иретелгән пептидтар өсөн, аликвотаға бүлергә һәм -20°С температурала һаҡларға кәңәш ителә; әгәр пептидтар эҙмә-эҙлегендә метионин Мет булһа (М), цистеин кислотаһы Cys (С) йәки тирозин Тир (Y) окисланыуын булдырмау өсөн кислородһыҙ мөхиттә һаҡларға кәңәш ителә.
Беркетелгән аминокислоталар исемлеге:
1.Нейтраль аминокислоталар: глицин, аланин, лейцин, изолейцин, валин, цистеин, метионин, треонин, серин, фенилаланин, тирозин, триптофан кислотаһы, пролин, аспарагин һәм глутамин
Fетуралар: Был төр аминокислота молекулаһында бер генә аминотөркөм һәм бер карбоксил төркөмө бар .
2.Кислоталы аминокислоталар: глутамин кислотаһы, аспартат кислотаһы
Сифаттар: Был типтағы аминокислота молекулаһында бер аминотөркөм һәм ике карбоксил төркөмө бар .
3.Төп аминокислоталар: лизин, аргинин, гистидин
Сифаттар: Был төр аминокислотаның молекулаһында диаминокарбоксил төркөмө бар .; гистидин азот йөҙөгөнә эйә һәм көсһөҙ һелтеле, һәм шулай уҡ төп аминокислота булып тора.
