Asianmukainen liukenemismenetelmä on tärkeä tekijä peptidikokeiden onnistumiselle. Virheellinen liukeneminen aiheuttaa peptidien menetyksen ja kokeen epäonnistumisen. Kuitenkin, Ihanteellisen liukenemismenetelmän löytäminen on joskus melko haastavaa. Seuraavat ovat MOL Changesin kahden teknisen ryhmän ehdottamat purkamismenetelmät. menetelmä
MOL Changes Technology Groupin purkamisopas
Peptidin liukenemisen pääongelma on sekundaarirakenteen muodostuminen.
Vaikka hydrofobisten peptidiketjujen sekundaaristen rakenteiden muodostuminen on ilmeisempi, lukuun ottamatta lyhyimpiä peptidiketjuja, tämä ilmiö esiintyy lähes kaikissa peptidiketjuissa, napaisuudesta riippumatta. Siksi, ensimmäinen periaate polypeptidien liuottamiseksi on käyttää steriiliä tislattua vettä tai deionisoitua vettä (tai hapetonta vettä, jos olosuhteet sen sallivat).
Peptidiliuos voi kohdata bakteerien hajoamista. Tämän ilmiön välttämiseksi, peptidi tulee liuottaa steriiliin tislattuun veteen, tai suodatetaan suodatinkalvolla, jonka huokoskoko on 0.45 tai 0.2 μm sterilointiin. Polypeptidit, jotka sisältävät Cys, Met, ja Trp ovat erityisen herkkiä hapettumiselle, joten ne tulee liuottaa hapettomaan veteen. Happitonta vettä voidaan saada poistamalla kaasut alennetussa paineessa ruiskuttamalla inerttejä kaasuja (typpeä, heliumia, ja argon).
Jos peptidi on liukenematon puhtaaseen veteen, ultraäänikäsittely voi auttaa hajottamaan hiukkasia ja lisäämään liukoisuutta. Huom: Ultraäänikäsittely aiheuttaa liuoksen kuumenemisen ja peptidin hajoamisen.
Jos peptidi sisältää useita emäksisiä aminohappoja, käytä 1-10 % etikkahapon vesiliuosta; erittäin hydrofobisille peptideille, käyttää 50% etikkahappo.
Jos polypeptidi sisältää suuren määrän happamia aminohappoja, se voidaan liuottaa a 1 to 10% ammoniakkiliuos tai haihtuva alkalinen puskuri, kuten etyylimorfiiniasetaatti tai bikarbonaatti. pH-arvo on säädettävä ennen kromatografiaa.
Jos peptidi ladataan pylvääseen, orgaanisen liuottimen määrän on oltava hyvin pieni, muuten säilytysaika heikkenee vakavasti.
Jos polypeptidi on erittäin hydrofobinen, koska se sisältää aromaattisia hiilivetysivuketjuja, kuten Val, Leu, Met, Phe, Tyr, Ala, jne., tai on neutraali peptidi, kalvodenaturointiaineiden, kuten DMF:n tai DMSO:n, käyttö voi auttaa liuottamaan polypeptidiä:
a. Korkean pitoisuuden kalvodenaturoijat auttavat liuottamaan polypeptidiä tuhoamalla sen sekundaarirakenteen.
b. Kalvodenaturointiaineet soveltuvat peptidianalyysiliuosten valmistukseen, mutta ne voivat häiritä niiden biologisen aktiivisuuden tutkimusta.
c. DMF on paras denaturointiaine (suurin mahdollinen pitoisuus 30%), ja lisätään tipoittain, kunnes peptidi on liuennut.
d. Käänteisfaasikromatografian aikana, DMF virtaa ulos yhdessä eluentin etupiikin kanssa. Injektiomäärästä riippuen, huippuarvo voi olla hyvin korkea. Useimmat peptidit voivat eluoitua muutamassa minuutissa sen jälkeen, kun suuri määrä DMF on eluoitunut. Jos peptidiketju on pieni ja eluoituu liian aikaisin, peptidin määrä vähenee.
MOL Muutokset Tekninen ryhmä II Purkamisopas
Kuinka erottaa, ovatko aminohapot neutraaleja, hapan tai emäksinen, ja laske liukenemismenetelmä:
1. Määritä polypeptidisekvenssin jokainen hapan aminohappo, mukaan lukien asparagiinihappo Asp (D), glutamiinihappo Glu (E) ja C-terminaalinen karboksyyli-COOH kuten -1; jokainen emäksinen aminohappo, mukaan lukien arginiini Arg ( R), lysiini Lys (K), histidiini Hänen (H) ja N-terminaaliselle amino-NH2:lle on annettu arvo +1; neutraalit aminohapot ovat 0. Tämän perusteella, lasketaan koko polypeptidin arvo, ja pistemäärä on positiivinen Peptidejä, joiden pistemäärä on negatiivinen, kutsutaan peruspeptideiksi, niitä, joilla on negatiivinen pistemäärä, kutsutaan happamiksi peptideiksi, ja niitä, joiden pistemäärä on nolla, kutsutaan neutraaleiksi peptideiksi.
2. Jos se on alkalinen peptidi, yritä liuottaa se ensin vedellä; jos sitä ei voi hajottaa, yritä käyttää 10% – 30% etikkahappo; jos peptidi on edelleen liukenematon, yritä käyttää puhdasta etikkahappoa ja trifluorietikkahappoa (<50 μl) sen liuottamiseen, ja laimenna sitten peptidiliuos haluttuun pitoisuuteen.
3. Jos se on hapan peptidi, yritä liuottaa se ensin vedellä; jos sitä ei voida liuottaa veteen, yritä käyttää 13% ammoniakkivettä (v/v) sen liuottamiseen, ja laimenna peptidiliuos vaadittuun pitoisuuteen. Jos peptidisekvenssi sisältää kysteiinin Cys (C), sitä ei voi liuottaa emäksiseen liuokseen. Kokeile alla olevia menetelmiä.
4. Neutraalit peptidit liuotetaan yleensä orgaanisiin liuottimiin. Ensimmäinen, yritä käyttää asetonitriiliä (asetonitriili), tai metanolia (metanoli) tai isopropanoli (isopropanoli) liukenemaan; erittäin hydrofobisille peptideille, liuotetaan ensin pieneen määrään dimetyylisulfoksidia (DMSO) ja laimenna vedellä vaadittuun pitoisuuteen; jos peptidisekvenssi sisältää kysteiini Cys (C), käytä dimetyyliformamidia (DMF) tai N-metyylipyrrolidoni (NMP) purkamista varten. Peptideille, jotka ovat alttiita aggregaatiolle, lisää ensin 6 M guanidiini·HCl:a tai 8 M ureaa (Urea) hajottaa ne, ja laimenna ne sitten vaadittuun pitoisuuteen.
havainnollistaa:
1. Säilytyksen ja myöhemmän käytön helpottamiseksi, on suositeltavaa liuottaa peptidi pitoisuuteen noin 1-2 mg/ml.
2. Tavallista pakastekuivattua peptidijauhetta voidaan säilyttää -20°C:ssa yli vuoden ajan. Liuenneille peptideille, on suositeltavaa jakaa eriin ja säilyttää -20 °C:ssa; jos peptidisekvenssi sisältää metioniinin Met (M), kysteiinihappo Cys (C) tai tyrosiini Tyr (Y) on suositeltavaa varastoida hapettomassa ympäristössä hapettumisen estämiseksi.
Liitteenä aminohappoluettelo:
1.Neutraaleja aminohappoja: glysiini, alaniini, leusiini, isoleusiini, valiini, kysteiini, metioniini, treoniini, seriini, fenyylialaniini, tyrosiini, tryptofaanihappo, proliini, asparagiini ja glutamiini
Fsyövät: Tämäntyyppinen aminohappomolekyyli sisältää vain yhden aminoryhmän ja yhden karboksyyliryhmän
2.Happamat aminohapot: glutamiinihappo, asparagiinihappo
Ominaisuudet: Tämäntyyppinen aminohappomolekyyli sisältää yhden aminoryhmän ja kaksi karboksyyliryhmää
3.Perusaminohapot: lysiini, arginiini, histidiini
Ominaisuudet: Tämäntyyppinen aminohappo sisältää molekyylissään diaminokarboksyyliryhmän; histidiinissä on typpirengas ja se on heikosti emäksistä, ja on myös emäksinen aminohappo.
