Librerie di peptidi derivati ​​dal proteoma per la profilazione di specificità profonda di reagenti di modificazione N-terminale

Le proteine ​​e i peptidi N terminali sono obiettivi importanti per la modifica selettiva con reagenti chemioproteomici e strumenti di bioconiugazione. L'α-ammina N-terminale è presente solo una volta in ciascuna catena polipeptidica, rendendolo un bersaglio attraente per la bioconiugazione delle proteine. Nelle celle, nuovi N terminali possono essere generati mediante scissione proteolitica e catturati da reagenti di modificazione N-terminale che consentono l'identificazione a livello di proteoma di substrati di proteasi con spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS). La comprensione della specificità della sequenza N-terminale dei reagenti di modifica è fondamentale per ciascuna di queste applicazioni. Le librerie peptidiche derivate dal proteoma in combinazione con LC-MS/MS sono potenti strumenti per profilare la specificità della sequenza dei reagenti di modificazione N-terminale. Queste biblioteche sono molto diverse, e LC-MS/MS consente l'analisi delle efficienze di modifica di decine di migliaia di sequenze in un singolo esperimento. Le librerie di peptidi derivati ​​dal proteoma sono un potente strumento per profilare le specificità di sequenza dei reagenti di marcatura enzimatica e chimica dei peptidi. Subtiligasi e 2-piridincarbossaldeide (2PCA) sono due reagenti che sono stati sviluppati per la modificazione selettiva dei peptidi N-terminali e possono essere studiati utilizzando librerie peptidiche derivate dal proteoma. Questo protocollo delinea i passaggi per generare librerie peptidiche derivate dal proteoma N-terminale diverse e per applicare queste librerie per profilare la specificità dei reagenti di modificazione N-terminale. Descriviamo in dettaglio i passaggi per profilare la specificità della 2-piridinecarboxaldeide, un reagente di modificazione chimica, e subtiligasi, un reagente di modificazione enzimatica. Questi protocolli possono essere facilmente adattati a fonti proteomiche alternative e ad altri reagenti per l'etichettatura dei peptidi N-terminali.